Summary
En kirurgisk prosedyre er beskrevet for å utføre injeksjoner i lumbalsisternen til den unge rotten. Denne tilnærmingen har blitt brukt til intratekal levering av genterapivektorer, men det forventes at denne tilnærmingen kan brukes til en rekke terapier, inkludert celler og legemidler.
Abstract
Genterapi er en kraftig teknologi for å levere nye gener til en pasient for behandling av sykdom, det være seg å introdusere et funksjonelt gen, inaktivere et giftig gen eller gi et gen hvis produkt kan modulere sykdommens biologi. Leveringsmetoden for den terapeutiske vektoren kan ha mange former, alt fra intravenøs infusjon for systemisk levering til direkte injeksjon i målvevet. Ved nevrodegenerative lidelser er det ofte ønskelig å skjeve transduksjon mot hjernen og/eller ryggmargen. Den minst invasive tilnærmingen for å målrette mot hele sentralnervesystemet involverer injeksjon i cerebrospinalvæsken (CSF), slik at terapien kan nå en stor brøkdel av sentralnervesystemet. Den sikreste tilnærmingen for å levere en vektor inn i CSF er den lumbale intratekale injeksjonen, hvor en nål føres inn i lumbalcisternen i ryggmargen. Denne teknikken, også kjent som en lumbalpunksjon, har blitt mye brukt hos nyfødte og voksne gnagere og i store dyremodeller. Selv om teknikken er lik på tvers av arter og utviklingsstadier, krever subtile forskjeller i størrelse, struktur og elastisitet av vev som omgir det intratekale rommet tilpasninger i tilnærmingen. Denne artikkelen beskriver en metode for å utføre lumbalpunksjon hos unge rotter for å levere en adeno-assosiert serotype 9-vektor. Her ble 25-35 μL vektor injisert i lumbalsisternen, og en grønn fluorescerende protein (GFP) reporter ble brukt til å evaluere transduksjonsprofilen som følge av hver injeksjon. Fordelene og utfordringene med denne tilnærmingen diskuteres.
Introduction
Løftet om virusmedierte genterapier har endelig blitt realisert de siste årene med FDA-godkjenning av behandlinger for spinal muskelatrofi, retinal dystrofi, faktor IX hemofili, kreft og mer 1,2,3,4. Utallige andre terapier er for tiden under utvikling. Genterapi tar sikte på å levere et terapeutisk gen til pasientens celler. Produktene til dette nye genet kan erstatte den manglende aktiviteten fra et mangelfullt endogent gen, hemme et giftig gen, drepe kreftceller eller gi en annen gunstig funksjon.
For sykdommer som påvirker sentralnervesystemet (CNS), er det ofte ønskelig å levere genterapivektoren direkte til målvevet. Ikke-systemiske tilnærminger gir to fordeler: de minimerer bivirkninger utenfor målet som kan være forårsaket av perifer transduksjon, og de reduserer mengden vektor som trengs for å oppnå tilstrekkelige transduksjonsnivåer i målvevet5.
Det finnes en rekke tilnærminger for å levere genterapivektorer til CNS. Intraparenkymal injeksjon, injeksjon av en vektor direkte i ryggmargen eller hjernevevet, kan brukes til levering til et definert område. For mange sykdommer er det imidlertid ønskelig med bred transduksjon av CNS. Dette kan oppnås ved å levere en vektor til cerebrospinalvæsken (CSF)5, væsken som strømmer i og rundt hjernen og ryggmargen. Det er tre primære måter å levere vektorer til CSF på. Den mest invasive tilnærmingen er intracerebroventrikulær levering, som innebærer å bore et borehull gjennom hodeskallen og føre en nål gjennom hjernen inn i laterale ventrikler. Dette gir transduksjon i hele hjernen. Imidlertid kan prosedyren forårsake intrakraniell blødning, og tilnærmingen gir generelt bare begrenset transduksjon av ryggmargen6. Injeksjon i cisterna magna ved bunnen av hodeskallen er mindre invasiv, men medfører risiko for skade på hjernestammen. Selv om det ofte brukes i dyreforsøk5, brukes injeksjon i cisterna magna ikke lenger rutinemessig i klinikken7. Lumbalpunksjon er den minst invasive tilnærmingen for å få tilgang til CSF. Dette innebærer å plassere en nål mellom to korsryggvirvler og inn i korsryggen.
Lumbalpunksjon for vektorlevering utføres rutinemessig hos voksne rotter og mus og hos nyfødte mus 8,9. Forfatterne av denne studien utførte nylig lumbalpunksjoner hos unge rotter (28-30 dager gamle) for å levere adeno-assosierte virusserotype 9 (AAV9) vektorer. Hos voksne rotter ble en neonatal lumbal punksjonsnål plassert vertikalt mellom L3- og L4-ryggvirvlene9. Riktig plassering resulterer i en haleflikk og CSF som strømmer opp i nålereservoaret. Hos unge rotter kunne imidlertid ingen av disse avlesningene oppnås. Forfatterne forsøkte deretter å tilpasse en voksen museprosedyre ved hjelp av en 27 G insulinsprøyte satt inn i en vinkel mellom L5 og L610. Hos voksne mus, som vanligvis er mindre enn P28-rotter, gir dette ikke en haleflikk, men feil nåleplassering er tydelig ved tilbakestrømningen av injektatet. Hos unge rotter førte imidlertid denne tilnærmingen jevnt til at injekatet ble levert epiduralt, sannsynligvis som følge av ulik elastisitet mellom voksne mus og unge rotter i vevslagene rundt ryggmargen. Katetertilnærminger ble deretter evaluert. Nærmere bestemt ble et kateter introdusert gjennom et snitt i dura av lumbalsisternen og opp til midten av thorax ryggmargen; Denne tilnærmingen førte imidlertid til betydelig refluks av injektatet tilbake ut av snittstedet under fødselen. Forsøk på å plassere kateteret i det intratekale rommet perkutant ved hjelp av en guidenål var heller mislykket. På grunn av smalheten i den interlaminære bredden, vil kateteret sannsynligvis treffe rostral lamina og ikke komme frem.
Her beskrives en metode for å oppnå vellykket og reproduserbar løsningstilførsel via lumbalpunksjon hos ungrotte. Denne tilnærmingen kan brukes for virale vektorer, og sannsynligvis også for celler, legemidler og andre terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble godkjent av Emory University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Sprague-Dawley-rotter (28-30 dager gamle, masse i området ca. 90-135 g, hanner og hunner) ble brukt i denne studien.
1. Klargjøring av vektoren
- Tin AAV9-vektoren (se materialtabell) på is i begynnelsen av prosedyren.
- Sentrifuger mikrosentrifugerøret som inneholder vektoren kort i en bordsentrifuge for å sikre at all væsken er i bunnen av røret.
- Sveip forsiktig på mikrosentrifugerøret for å sikre at løsningen er godt blandet.
2. Klargjøring av gjenopprettingsburet
- Plasser et rent bur på et elektrisk teppe (se materialfortegnelse) slik at bare halvparten av buret er i kontakt med teppet.
- Still inn temperaturen på teppet til ~37 °C.
3. Klargjøring av den kirurgiske plattformen
- Varm opp en isotermisk pute (se materialfortegnelse) til 39 °C i mikrobølgeovn eller vannbad slik at innholdet blir flytende.
- Plasser den isotermiske puten på operasjonsplattformen og dekk den til med en ren absorberende benkpute.
4. Forberedelse av dyr
- Bedøve rottene med isofluran i en gjennomsiktig boks (etter institusjonelt godkjente protokoller). Begynn anestesiinduksjonen med 5 % isofluran, og trapp ned 1 % per minutt til du når 2 %. Hold dyret på 2 % i ytterligere 3 minutter.
- Flytt boksen som holder dyret til et avtrekkshette og åpne boksen.
MERK: Dette begrenser kirurgens eksponering for bedøvelsesmidlet. - Fjern håret fra baksiden av dyret ved hjelp av elektriske hårklippere.
NOTAT: Alternativt kan en hårfjerningskrem eller manuell barberhøvel og barberkrem brukes. - Plasser dyret på den kirurgiske plattformen med snuten i anestesi-nesekjeglen.
MERK: Dyret kan begynne å gjenvinne bevisstheten mens pelsen fjernes fra operasjonsstedet. Hvis dette skjer, bedøve det igjen som beskrevet ovenfor. - Påfør smørende øyesalve på hvert øye for å forhindre uttørking av hornhinnene under prosedyren.
- Desinfiser det kirurgiske området ved hjelp av tre vekslende påføringer av povidon-jod- og isopropanolservietter.
- Injiser smertestillende midler subkutant.
MERK: Buprenorfin brukes vanligvis i en dose på 0,01-0,05 mg/kg, gitt hver 12. Alternativt kan en form med langsom frigjøring av dette legemidlet gis én gang ved 1 mg/kg for å gi tilstrekkelig smertekontroll i 72 timer. Rådfør deg med institusjonens IACUC for deres retningslinjer angående smertebehandling. - Injiser 100 μL 1 % lidokain subkutant over L2 til L6 spinøse prosesser for å gi lokalbedøvelse.
- Legg en rull papirhåndkle eller et rør på 1,5 cm i diameter under dyret, bare rostral til hoftene. Dette hjelper til med å bøye ryggraden, noe som gjør det lettere å stikke nålen inn mellom de to laminaene.
- Plasser en fenestrert gardin (se materialfortegnelse) på dyret, sentrer fenestrasjonen over korsryggen.
5. Eksponere korsryggen
- Bekreft dybden av anestesien ved å klype hver av dyrets poter og se etter fraværet av en abstinensrespons.
- Bruk et #11 skalpellblad til å lage et snitt på omtrent 3 cm langt i huden nedover midtlinjen fra L2 til L6.
- Løsne huden fra muskelen ved å sette inn en steril buet kirurgisk saks mellom muskelen og huden og deretter åpne spissene.
- Fjern fascien som dekker L2-L5 spinøse prosesser.
6. Påfylling av sprøyten
- Pipetter 25-35 μL av vektoren (for å oppnå ønsket dose) inn i hetten på et sterilt mikrosentrifugerør.
- Trekk hele volumet inn i insulinsprøyten.
NOTAT: Pass på at du ikke trekker opp luft under denne prosessen.
7. Utføre injeksjonen
- Identifiser L5- og L4-spinøse prosesser.
NOTAT: L6 sitter rett mellom de to hoftekammene, og dens spinøse prosess skal være lett å identifisere ved å sondere med et sløvt instrument. Instrumentet kan deretter kjøres forsiktig oppover ryggen for å finne grensene for L5- og L4-prosessene. - Plasser den ene hånden slik at tommelen hviler forsiktig på dyrets hale og det ene benet. Bruk en finger til å stabilisere sprøyten.
- Plasser nålen på sprøyten slik at den er til venstre for L5-spinøs prosess og på linje med haleenden. Plasser sprøyten slik at den er ca. 30° fra midtlinjen og 30° opp fra bordets plan.
NOTAT: Det kan være nyttig å bruke et kirurgisk mikroskop for bedre å identifisere landemerker og plassere nålespissen. - Før sprøytenålen ca. 8 mm fremover, over toppen av L5-laminaen og deretter under L4-laminaen inn i lumbalsisternen til benet er truffet. Riktig plassering vil resultere i en rykning i benet og/eller halen som kan sees eller kjennes av tommelen som hviler på benet/halen. Hvis det ikke er noen rykninger, fjern nålen og prøv prosedyren fra venstre side. Hvis det fortsatt ikke er noen rykninger, gjenta prosedyren mellom L4/L3 og L3/L2 etter behov.
- Trykk stempelet sakte ned i ca. 5 s.
MERK: Det kan være en rykning i benet eller halen under injeksjonen. - Hold sprøyten på plass i ca. 30 sekunder etter at du har trykket stempelet helt ned for å la trykket komme i likevekt og minimere tilbakeløp av injektatet når kanylen trekkes ut.
- Fjern nålen sakte.
8. Lukking av snittet
- Omtrentlig kantene på snittet.
- Begynn i den ene enden av såret, bruk en 4-0 sutur (se materialtabell) eller kirurgiske stifter for å lukke snittet.
9. Gjenoppretting og overvåking
- Plasser dyret i det forvarmede buret.
- Sjekk dyret minst hvert 15 minutt til det er helt gående.
MERK: Dette bør ta mellom 15 min og 45 min. - De neste tre dagene, utfør velværesjekker minst daglig. Gi smertestillende midler de første 2 dagene etter operasjonen eller som påkrevd av IACUC.
- En uke etter operasjonen, fjern suturene eller stiftene.
10. Prosedyre for oppfølging
NOTAT: For å bestemme nøyaktigheten av injeksjonsteknikken, injiser trypanblått fargestoff som beskrevet ovenfor og avliver deretter dyret umiddelbart (i henhold til institusjonelt godkjente protokoller) og utfør en laminektomi for å visualisere resultatet.
- Mens dyret forblir under narkose, avlives det ved å administrere en dødelig dose pentobarbital via intraperitoneal injeksjon i en dose på 150 mg/kg.
- Når respirasjon og hjerteaktivitet opphører, åpner du brysthulen for å sikre død. Forleng det kirurgiske snittet oppover ryggen til nakken.
- Gjør et snitt 4 cm langt inn i muskelen parallelt med ryggraden på begge sider av de spinøse prosessene, og hold deg så nær prosessene som mulig.
- Bruk fin tang eller saks til å fjerne muskelen mellom de spinøse prosessene.
- Fjern de spinøse prosessene fra L6 opp til den nedre thorax ryggraden ved hjelp av en rongeur (se materialtabell). Unngå vridende bevegelser, da dette kan skade rongeurene.
- Sett den nedre spissen av rongeur under L5-laminaen og fjern beinet som ligger over ryggmargen ved å ta flere "bitt" ut av den.
NOTAT: Å trekke tilbake på L6 spinøs prosess kan gjøre det lettere å sette inn spissen av rongeuren. Det må utvises forsiktighet for å forhindre skade på ryggmargen. - Fortsett å utvide laminektomien minst fire laminae rostralt. Inspiser den indre overflaten av laminae for tegn på fargestoff, noe som kan indikere en mislykket injeksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å bestemme nøyaktigheten av injeksjonsteknikken ble et fargestoff, trypan blått, brukt som surrogat for terapeuten. Dette fargestoffet binder seg lett til proteiner, så det holder seg vanligvis innenfor strukturen det ble injisert i. Dette betyr at fargestoffet kanskje ikke nøyaktig forutsier fordelingen av det terapeutiske stoffet etter injeksjon; Den brukes ganske enkelt til å avsløre nøyaktigheten av injeksjonen. Når den er vellykket introdusert i korsryggen, binder trypanblått seg til dura mater, og farger omkretsen av ryggmargen blå. Men når nålen ikke klarer å trenge inn i dura mater, havner fargestoffet i epiduralrommet. Både dura mater og det omkringliggende vevet (overflaten av beinet og leddbåndene og musklene som forbinder laminae) vil bli farget blått. Disse mønstrene er lett synlige for det blotte øye.
Forskjellen mellom riktig og feil administrert injeksjon er vanskelig å vurdere hvis man bare gjør et tverrgående kutt gjennom ryggmargen og ryggsøylen. I stedet anbefales det å utføre en laminektomi ved hjelp av et par rongeurs som begynner ved L5-laminaen og beveger seg rostralt. Det må utvises forsiktighet for ikke å skade dura mater i prosessen. Bruk av disseksjonsmikroskopet gjør denne prosessen enklere. Figur 1 gir sammenlignende eksempler på vellykkede injeksjoner og bare delvis vellykkede injeksjoner. Med en vellykket injeksjon observeres lite eller ingen refluks langs nålesporet når nålen trekkes ut. Etter en vellykket injeksjon avslører fjerning av laminaen for å eksponere ryggmargen trypanblått i ryggmargen, men ikke på overflaten av benet (figur 1A). Fargestoffet er også synlig på hjernestammen og lillehjernen etter en vellykket injeksjon (figur 1B). Derimot er en delvis vellykket injeksjon bevist ved betydelig refluks av fargestoff tilbake opp i nålekanalen under injeksjonsprosessen og/eller synlige tegn på fargestoff på beinet (figur 1C).
Ved bruk av prosedyren ovenfor ble 28 μL av en AAV9-vektor som uttrykker forbedret grønt fluorescerende protein (GFP) injisert i en konsentrasjon på 3 x 1013 vektorgenomer/ml, for en total dose på 8,4 x 1011 vektorgenomer/dyr. Fire uker senere ble dyrene avlivet og perfundert med 4 % paraformaldehyd10. Hjernen og ryggmargen ble deretter høstet og klargjort for frossen seksjonering. 40 μm tykke seksjoner ble oppnådd og farget for GFP. Figur 2 gir eksempler på transduksjonsmønsteret oppnådd med denne vektoren. Transduksjonen var generelt høyest i ryggmargen, spesielt i lumbalregionen (figur 2A-C), sannsynligvis på grunn av dens nærhet til injeksjonsstedet. Transduksjonen av hjernen ble oppnådd (figur 2D-F), men som forventet hadde den en tendens til å være mer begrenset enn det man så i ryggmargen.
For å illustrere reproduserbarheten av resultater oppnådd av en enkelt, erfaren kirurg ved bruk av et enkelt parti virus, er fargede deler av lillehjernen og cortex fra hver av de 15 rottene som ble injisert for denne studien presentert i henholdsvis figur 3 og figur 4. De fargede delene av cervikal ryggmarg er også presentert for 7 av disse 15 rottene (figur 5). Selvfølgelig kan mengden hjernetransduksjon vise enda større variasjon med forskjellige doser, vektorpartier og kirurger10.
Figur 1: Eksponering av ryggmargen etter injeksjon av fargestoffet. Laminektomi ble utført etter injeksjon av trypanblått. (A) Ryggmargen er farget blå i en korrekt administrert injeksjon, og det er ikke sett noe fargestoff på beinet som er fjernet under laminektomien (piler). (B) Fargestoffet kan også observeres rundt hjernestammen. (C) I en injeksjon der det var betydelig refluks under injeksjonen, er det mindre fargestoff i strengen, og fargestoff er tilstede på overflaten av beinet (piler). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Eksempler på transduksjonsmønstre oppnådd etter intratekal levering av AAV9-GFP. 40 μm tykke seksjoner av (A) cervikal, (B) thorax og (C) lumbal ryggmarg ble immunhistokjemisk farget for GFP (svart flekk). Høye nivåer av gråsubstanstransduksjon ble observert på alle nivåer. (D) Derimot viser hjernen sparsommere total transduksjon. Venstre og høyre boks forstørres i henholdsvis (E) og (F). (E) Størstedelen av fargingen observeres i lillehjernen, først og fremst i Purkinje-nevroner (piler). (F) Nevroner (piler) og astrocytter (pilspisser) transduseres i hjernebarken. Skalastenger: (A-C) 325 μm; (D) 5 mm; og (E,F) 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Reproduserbarhet av transduksjon i lillehjernen. Reproduserbarhet av transduksjon i lillehjernen hos 15 rotter injisert av samme kirurg med samme dose og parti av viruset. Målestokk: 1 mm. Tallene på bildene indikerer rotte-ID-numrene ('kull'.' individ'). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Reproduserbarhet av transduksjon i cortex. Reproduserbarhet av transduksjon i cortex hos 15 rotter injisert av samme kirurg med samme dose og parti virus. Skalastang: 500 μm. Tallene på bildene indikerer rotte-ID-numrene ('kull'.' individ'). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Reproduserbarhet av transduksjon i cervikal ryggmarg. Reproduserbarhet av transduksjon i cervikal ryggmarg hos 7 rotter injisert av samme kirurg med samme dose og parti virus. Skalastang: 500 μm. Tallene på bildene indikerer rotte-ID-numrene ('kull'.' individ'). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et bredt utvalg av sykdommer påvirker CNS. Å gi en funksjonell kopi av det aktuelle genet via en viral vektor er en attraktiv behandlingsstrategi for de som er recessive og monogene i naturen, for eksempel spinal muskelatrofi. Blod-hjerne-barrieren (BBB) utelukker imidlertid de fleste genterapivektorer gitt intravenøst11. De som kan krysse BBB, for eksempel AAV9, må gis i høye doser for å overvinne vektortapet på grunn av perifer transduksjon12. Alderen er også en barriere. Miljøeksponering for de ulike AAV-serotypene øker med13-årsalderen og fører ofte til produksjon av antistoffer som kan nøytralisere terapeutiske vektorer14. Derfor er intravenøs levering av genterapivektorer for CNS-lidelser generelt begrenset til spedbarn og brukes ikke hos pasienter diagnostisert senere i livet.
For eldre pasienter kan direkte vektorinjeksjon i CSF gi bred transduksjon i CNS, og omgå både BBB og eksisterende anti-AAV-antistoffer15. Siden denne tilnærmingen er målrettet, kan lavere vektordoser også brukes. Det er to primære tilnærminger i klinisk setting: (1) lumbalpunksjon og (2) injeksjon i laterale ventrikler. Sistnevnte medfører mer risiko, men gir generelt større hjernetransduksjon. Spinalpunksjon er tryggere, men transduksjon er skjev mot ryggmargen. Hjernetransduksjon kan forbedres ved å plassere pasienten i Trendelenburg-stilling, men data om dette er blandet16,17. Bruk av kateter for å nå cisterna magna via spinalpunksjon kan gi et bedre alternativ i klinikken, men det er i et tidlig stadium av bruk5. Det kan være andre utfordringer med å oversette tilnærminger utarbeidet i dyremodeller til klinikken, for eksempel vektortap på grunn av CSF-lekkasje18 og toksisitet i dorsale rotganglier19.
De fleste studier av CNS-rettede terapier utført på gnagere bruker nyfødte eller voksne dyr (>60 dagers alder). Nyfødte har fordelen av en liten kroppsstørrelse, noe som gir høyere effektive doser, og et umoden immunsystem, og unngår komplikasjonene av en immunrespons mot terapeutisk. Men når det gjelder hjerneutvikling, representerer en nyfødt mus eller rotte bedre et fosterstadium hos mennesker. For terapier beregnet på barn i aldersgruppen 5-10 år er den unge rotta (25-35 dager gammel) en bedre modell når det gjelder nevrologisk utvikling20. Siden en metode for intratekal injeksjon ikke tidligere var beskrevet for unge rotter, og metoder etablert for voksne mus og rotter viste seg å være ineffektive hos rotter i denne alderen, ble tilnærmingen beskrevet ovenfor utviklet. For å være tydelig, er unge rotter ikke bare mindre enn voksne, men kan også variere i elastisiteten til dura som beskytter ryggmargen, noe som gjør en prosedyre som fungerer for å punktere dette laget hos en voksen rotte ineffektiv hos en ung.
Når du lærer å utføre intratekal injeksjon hos unge rotter, er det nødvendig å bruke et fargestoff (som trypanblått) som surrogat for terapien, og brukeren bør være svært trygg på deres evne til å utføre prosedyren på en vellykket og reproduserbar måte før du starter en studie med et terapeutisk middel. Å bli dyktig i teknikken vil kreve øvelse for å få erfaring med hvordan sprøyten føles når banen er på mål versus utenfor målet. Det er to vanlige feil. Hvis tilnærmingsvinkelen er for grunn, vil nålen treffe toppen av en av laminae eller baksiden av rostrallaminaen. Det vil ikke være noen rykninger, og avstanden som nålen går fremover vil være noen millimeter under 8 mm. Hvis tilnærmingsvinkelen er for stor, er det fare for at nålen passerer mellom de to lamellerne og trenger inn i bukhulen. Når dette skjer, vil nålen gå mye lenger enn 8 mm. Hvis dette skjer, fjern nålen, flytt og prøv igjen. Ved de få anledningene dette har skjedd, har forbigående inntrengning i bukhulen med noen få millimeter før tilbaketrekking og reposisjonering ikke forårsaket noen tilsynelatende varig skade på dyrene.
Det har vist seg at å observere en fysisk respons på plasseringen av nålen er avgjørende for å oppnå reproduserbarhet med høy suksessrate med denne prosedyren. Når det ikke kom respons, var suksessraten for injeksjonen lav. Men i noen tilfeller krevde et dyr forsøk på flere steder for å oppnå en respons, og spormengder av fargestoff ble observert i ett eller flere av de tidligere nålesporene. Ingen fargestoff ble observert i epiduralrommet, noe som tyder på at noen av de tidligere nålestikkene hadde trengt inn i dura uten å produsere en rykning i halen eller benet. Siden refluksen var minimal (tilsvarende det som er observert i nålesporet fra injeksjonen), antas det at effekten av tidligere nålestikk på leveringseffekten i disse tilfellene var ubetydelig.
Når man oppnår ferdigheter i fødselsteknikken, kan en andre, ikke-kirurgisk utfordring oppstå. Spesielt hos voksne rotter (~70 dager gamle), kan styrken til AAV9-vektorer for intratekal levering til ryggmargen og hjernen variere betydelig fra parti til parti, selv når de genereres av samme vektorkjerne. Noen batcher vil fungere som forventet, og gi transduksjon i ryggmargens grå substans langs lengden. Andre vil imidlertid ikke klare å trenge gjennom den grå substansen, først og fremst transdusere dorsale rotganglier10. Årsaken til denne variasjonen er uklar, da vektorene er potente in vitro og når de injiseres direkte i ryggmargen. Det anbefales at en pilotstudie av 3-4 dyr utføres med et nytt parti virus for å bekrefte at det nye partiet fungerer som forventet før du starter en stor studie. Styrken kan vurderes ved hjelp av enten immunhistokjemisk eller immunfluorescensfarging av proteintransgenproduktet eller kvantifisering av mengden transgen-mRNA eller vektorgenomer ved bruk av kvantitativ PCR eller ddPCR21. I tillegg til de ukjente variablene som skiller virale partier, kan små forskjeller i dyrealder, injeksjonsvolum, leveringshastighet og vektorkonsentrasjon forårsake variasjon i resultatene. Før du starter en stor studie, kan det hende de må optimaliseres for hvert virus eller andre kandidatterapeutiske midler.
Når den er opplært, kan en erfaren kirurg fullføre den intratekale injeksjonsprosedyren til en juvenil rotte innen ca. 30 minutter, fra anestesiinduksjon til begynnelsen av restitusjonsperioden. Dette gjør det mulig å behandle store kohorter på kort tid. Restitusjonen etter operasjonen er også rask. De fleste dyrene vandrer normalt innen 20-30 min. Etter å ha utført mer enn 200 av disse operasjonene, har ingen bivirkninger fra denne prosedyren blitt oppdaget.
Til slutt er det avgjørende å minimere dyrenes nød og sikre dyrevelferd under kirurgiske prosedyrer. Dermed er riktig bruk av bedøvelsesmidler og smertestillende midler nødvendig, og kroppstemperaturen må opprettholdes under prosedyren og til dyret kommer seg helt etter anestesi. De relevante reguleringsorganene og veterinærpersonellet ved ulike institusjoner kan ha ulike krav og anbefalinger angående disse temaene. Bruken av bedøvelsesmidler og smertestillende midler beskrevet i denne prosedyren ble utviklet i samråd med Emory Universitys veterinærer og IACUC-ansatte. Forskere bør jobbe tett med sine lokale veterinærer og IACUC for å nå de nødvendige målene.
Det er visse begrensninger for denne prosedyren. Metoden beskrevet her ble utviklet for bruk hos unge rotter, og utallige strukturelle og andre forskjeller mellom mennesker og rotter kan begrense oversettelsen av disse prosedyrene til mennesker. Poenget med å muliggjøre lumbal intratekal injeksjon av et terapeutisk middel hos unge rotter er å lette bruken av juvenil rottemodell for å teste effekten av den terapeutiske kandidatbehandlingen - selv om den nøyaktige leveringsmåten må endres for bruk hos pasienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Donsante er en oppfinner på et ventende patent angående CSF-administrering av AAV9-vektorer.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Steven Gray, Matthew Rioux, Nanda Regmi og Lacey Stearman fra UT Southwestern for en produktiv diskusjon om utfordringen med unge rotter for intratekal injeksjon. Dette arbeidet ble delvis støttet av midler fra Jaguar Gene Therapy (til JLFK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 µL filtered pipette tips | MidSci | PR-200RK-FL | Pipetting virus |
| AAV9-GFP | Vector Builder | P200624-1005ynr | AAV9 vector expressing GFP |
| Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 Braided | McKesson | J422H | Suture |
| Bench pad | VWR | 56616-031 | Surgery |
| Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8'' | Fisher Scientific | 50-195-4664 | Maintains body temperature |
| Buprenorphine | McKesson | 1013922 | Analgesic |
| Buprenorphine-ER (1 mg/mL) | Zoopharma | Extended-release analgesic | |
| Cotton swabs | Fisher Scientific | 19-365-409 | Blood removal |
| Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration | Steris | 1212CPSTF | Surgical drape |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Forceps |
| Electric Blanket | CVS Health | CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad | |
| Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL | Eppendorf | 3123000055 | Pipetting virus |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | Curved surgical scissors |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | Laminectomy |
| Halsey Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | Needle driver |
| Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc | BD | 328431 | Syringe |
| Isoflurane | McKesson | 803250 | Anesthetic |
| Isopropanol wipes | Fisher Scientific | 22-031-350 | Skin disinfection |
| Lidocaine, 1% | McKesson | 239935 | Local anesthesia |
| Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-137 | Loading the syringe |
| Povidone-iodine | Fisher Scientific | 50-118-0481 | Skin disinfection |
| Scalpel Handle - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Scalpel blade holder |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific | EZ-17 | Anesthesia box |
| Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped | McKesson | 4-111 | #11 Scalpel blade |
| SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment | Alcon | Eye ointment | |
| Trypan Blue | VWR | 97063-702 | Injection |
References
- Wurster, C., Petri, S. Progress in spinal muscular atrophy research. Curr Opin Neurol. 35 (5), 693-698 (2022).
- Wu, K. Y., et al. Retinitis pigmentosa: Novel therapeutic targets and drug development. Pharmaceutics. 15 (2), 685 (2023).
- Larkin, H. First FDA-approved gene therapy for hemophilia. JAMA. 329 (1), 14 (2023).
- Lee, A.
- Taghian, T., et al. A safe and reliable technique for CNS delivery of AAV vectors in the cisterna magna. Mol Ther. 28 (2), 411-421 (2020).
- Donsante, A., et al. Intracerebroventricular delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the adult rat brain. Gene Ther. 23 (5), 401-407 (2016).
- Pellot, J. E., Jesus, O. D. Suboccipital puncture. [Updated 2022 Jul 25]. StatPearls [Internet]. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2022).
- Elliger, S. S., Elliger, C. A., Aguilar, C. P., Raju, N. R., Watson, G. L. Elimination of lysosomal storage in brains of MPS vii mice treated by intrathecal administration of an adeno-associated virus vector. Gene Ther. 6 (6), 1175-1178 (1999).
- De La Calle, J. L., Paino, C. L. A procedure for direct lumbar puncture in rats. Brain Res Bull. 59 (3), 245-250 (2002).
- O'connor, D. M., Lutomski, C., Jarrold, M. F., Boulis, N. M., Donsante, A. Lot-to-lot variation in adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) preparations. Hum Gene Ther Methods. 30 (6), 214-225 (2019).
- Manfredsson, F. P., Rising, A. C., Mandel, R. J. AAV9: A potential blood-brain barrier buster. Mol Ther. 17 (3), 403-405 (2009).
- Hudry, E., Vandenberghe, L. H. Therapeutic AAV gene transfer to the nervous system: A clinical reality. Neuron. 101 (5), 839-862 (2019).
- Georg-Fries, B., Biederlack, S., Wolf, J., Zur Hausen, H. Analysis of proteins, helper dependence, and seroepidemiology of a new human parvovirus. Virology. 134 (1), 64-71 (1984).
- Schulz, M., et al. Binding and neutralizing anti-aav antibodies: Detection and implications for rAAV-mediated gene therapy. Mol Ther. 31 (3), 616-630 (2023).
- Gray, S. J., Nagabhushan Kalburgi, S., Mccown, T. J., Samulski, J. R. Global CNS gene delivery and evasion of anti-aav-neutralizing antibodies by intrathecal aav administration in non-human primates. Gene Ther. 20 (4), 450-459 (2013).
- Meyer, K., et al. Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for sma: A dose-response study in mice and non-human primates. Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).
- Hinderer, C., et al. Evaluation of intrathecal routes of administration for adeno-associated viral vectors in large animals. Hum Gene Ther. 29 (1), 15-24 (2018).
- Wang, Y. F., et al. Cerebrospinal fluid leakage and headache after lumbar puncture: A prospective non-invasive imaging study. Brain. 138, 1492-1498 (2015).
- Hordeaux, J., et al. Adeno-associated virus-induced dorsal root ganglion pathology). Hum Gene Ther. 31 (15-16), 808-818 (2020).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106-107, 1-16 (2013).
- Fang, H., et al. Comparison of adeno-associated virus serotypes and delivery methods for cardiac gene transfer. Hum Gene Ther Methods. 23 (4), 234-241 (2012).
