Summary
Описана хирургическая методика выполнения инъекций в поясничный резервуар молодого крыса. Этот подход использовался для интратекальной доставки векторов генной терапии, но ожидается, что этот подход может быть использован для различных терапевтических средств, включая клетки и лекарственные препараты.
Abstract
Генная терапия — это мощная технология доставки новых генов пациенту для лечения заболевания, будь то введение функционального гена, инактивация токсичного гена или предоставление гена, продукт которого может модулировать биологию заболевания. Метод доставки терапевтического вектора может принимать различные формы, начиная от внутривенной инфузии для системной доставки и заканчивая прямым введением в ткань-мишень. При нейродегенеративных расстройствах часто желательно смещение трансдукции в сторону головного и/или спинного мозга. Наименее инвазивный подход к воздействию, направленный на всю центральную нервную систему, включает в себя инъекции в спинномозговую жидкость (ликвор), что позволяет терапевтическому эффекту достичь значительной части центральной нервной системы. Наиболее безопасным подходом для введения вектора в спинномозговую жидкость является поясничная интратекальная инъекция, при которой игла вводится в поясничный резервуар спинного мозга. Этот метод, также известный как люмбальная пункция, широко используется у новорожденных и взрослых грызунов, а также на крупных моделях животных. Несмотря на то, что метод схож у разных видов и стадий развития, тонкие различия в размере, структуре и эластичности тканей, окружающих интратекальное пространство, требуют аккомодации в подходе. В данной статье описан метод проведения люмбальной пункции у молодых крыс с целью доставки аденоассоциированного вектора серотипа 9. Здесь 25-35 мкл вектора вводили в поясничный отдел позвоночника, а для оценки профиля трансдукции, полученного в результате каждой инъекции, использовали репортер зеленого флуоресцентного белка (GFP). Обсуждаются преимущества и проблемы такого подхода.
Introduction
Перспектива вирусно-опосредованной генной терапии, наконец, была реализована в последние годы с одобрением FDA методов лечения спинальной мышечной атрофии, дистрофии сетчатки, гемофилии фактора IX, рака и других заболеваний. В настоящее время в разработке находится бесчисленное множество других терапевтических средств. Генная терапия направлена на доставку терапевтического гена в клетки пациента. Продукты этого нового гена могут замещать недостающую активность дефицитного эндогенного гена, ингибировать токсичный ген, убивать раковые клетки или выполнять какую-либо другую полезную функцию.
При заболеваниях, поражающих центральную нервную систему (ЦНС), часто бывает желательно доставить вектор генной терапии непосредственно в ткань-мишень. Несистемные подходы имеют два преимущества: они минимизируют побочные эффекты, которые могут быть вызваны периферической трансдукцией, и значительно уменьшают количество вектора, необходимого для достижения адекватных уровней трансдукциив целевой ткани.
Существует множество подходов к доставке векторов генной терапии в ЦНС. Интрапаренхиматозная инъекция, то есть инъекция вектора непосредственно в спинной мозг или ткань головного мозга, может быть использована для доставки в определенную область. Однако при многих заболеваниях желательна широкая трансдукция ЦНС. Это может быть достигнуто путем доставки вектора к спинномозговой жидкости (СМЖ)5, жидкости, которая течет в головном и спинном мозге и вокруг них. Существует три основных способа доставки векторов в спинномозговую жидкость. Наиболее инвазивным подходом является внутримозговая доставка, которая включает в себя сверление отверстия в черепе и продвижение иглы через мозг в боковые желудочки. Это приводит к трансдукции по всему мозгу. Тем не менее, процедура может вызвать внутричерепное кровоизлияние, и этот подход обычно приводит лишь к ограниченной трансдукции спинного мозга6. Инъекция в большую цистерну у основания черепа менее инвазивна, но несет риск повреждения ствола мозга. Несмотря на то, что инъекции в большую цистерну часто используются в исследованиях на животных5, они больше не используются рутинно в клинике7. Люмбальная пункция является наименее инвазивным подходом к доступу к спинномозговой жидкости. Это включает в себя введение иглы между двумя поясничными позвонками и в поясничный бачок.
Люмбальная пункция для доставки вектора обычно выполняется у взрослых крыс и мышей, а также у неонатальных мышей 8,9. Авторы этого исследования недавно провели люмбальную пункцию у молодых крыс (в возрасте 28-30 дней) для доставки векторов аденоассоциированного вируса серотипа 9 (AAV9). У взрослых крыс неонатальная игла для люмбальной пункции была размещена вертикально между позвонками L3 и L49. Правильное размещение приводит к взмаху хвостом и стеканию спинномозговой жидкости в игольчатый резервуар. Однако у молодых крыс ни одно из этих показаний не могло быть достигнуто. Затем авторы попытались адаптировать процедуру на взрослой мыши, используя инсулиновый шприц с концентрацией 27 г, вставленный под углом между L5 и L610. У взрослых мышей, которые обычно меньше, чем крысы P28, это не приводит к взмаху хвоста, но неправильное размещение иглы очевидно по обратному потоку инъекции. Однако у молодых крыс этот подход одинаково приводил к эпидуральной стимуляции инъекции, что, вероятно, является результатом разной эластичности слоев тканей, окружающих спинной мозг у взрослых мышей и молодых крыс. Далее оценивались катетерные доступы. В частности, катетер вводили через разрез в твердой мозговой оболочке поясничного отдела и до средней части грудного отдела спинного мозга; Однако такой подход приводил к значительному оттоку инъекции обратно из места разреза во время родов. Попытки ввести катетер в интратекальное пространство чрескожно с помощью направляющей иглы также не увенчались успехом. Из-за узкой межслойной ширины катетер, скорее всего, заденет ростральную пластинку и не сможет продвинуться вперед.
В данной работе описан метод достижения успешной и воспроизводимой доставки раствора с помощью люмбальной пункции у молодых крыс. Этот подход может быть использован для вирусных векторов, а также, вероятно, для клеток, фармацевтических препаратов и других терапевтических средств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование было одобрено Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Эмори. В настоящем исследовании использовались крысы Спрэг-Доули (возраст 28-30 дней, масса около 90-135 г, самцы и самки).
1. Подготовка вектора
- Разморозьте вектор AAV9 (см. Таблицу материалов) на льду в начале процедуры.
- Кратковременно центрифугируйте микроцентрифужную пробирку, содержащую вектор, в настольной центрифуге, чтобы убедиться, что вся жидкость находится на дне пробирки.
- Осторожно переверните микроцентрифужную пробирку, чтобы убедиться, что раствор хорошо перемешался.
2. Подготовка каркаса для восстановления
- Поместите чистую клетку на электрическое одеяло (см. Таблицу материалов) так, чтобы только половина клетки соприкасалась с одеялом.
- Установите температуру одеяла на ~37 °C.
3. Подготовка операционной платформы
- Нагрейте изотермическую прокладку (см. Таблицу материалов) до 39 °C в микроволновой печи или на водяной бане, чтобы содержимое стало жидким.
- Поместите изотермическую прокладку на хирургическую платформу и накройте ее чистой впитывающей скамьей.
4. Подготовка животных
- Обезболите крыс изофлураном в прозрачной коробке (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Начните индукцию анестезии с 5% изофлурана и снижайте ее на 1% в минуту до достижения 2%. Удерживайте животное при температуре 2% еще 3 минуты.
- Переместите коробку, удерживающую животное, в вытяжной шкаф и откройте коробку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это ограничивает воздействие анестетика на хирурга. - Удалите шерсть со спины животного с помощью электрических машинок для стрижки волос.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно использовать крем для депиляции или ручную бритву и крем для бритья. - Поместите животное на операционную платформу мордой в носовой конус для анестезии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Животное может начать приходить в сознание во время удаления шерсти с места операции. Если это произошло, сделайте ему еще раз обезболивание, как описано выше. - Нанесите смазывающую глазную мазь на каждый глаз, чтобы предотвратить пересыхание роговицы во время процедуры.
- Продезинфицируйте операционную область с помощью трех чередующихся применений салфеток с повидон-йодом и изопропанолом.
- Введите анальгетик (анальгетики) подкожно.
Примечание: Бупренорфин обычно применяют в дозе 0,01-0,05 мг/кг, вводят каждые 12 ч. В качестве альтернативы, можно однократно ввести форму этого препарата с медленным высвобождением в дозе 1 мг/кг для обеспечения адекватного контроля боли в течение 72 ч. Проконсультируйтесь с IACUC учреждения для получения рекомендаций по лечению боли. - Введите 100 мкл 1% лидокаина подкожно над остистыми отростками от L2 до L6 для обеспечения местной анестезии.
- Подложите под животное рулон бумажного полотенца или трубку диаметром 1,5 см, как раз рострально к бедрам. Это помогает согнуть позвоночник, облегчая введение иглы между двумя пластинками.
- Наложите фенестрированную простыню (см. Таблицу материалов) на животное, расположив фенестрацию по центру поясничного отдела позвоночника.
5. Обнажение поясничного отдела позвоночника
- Подтвердите глубину анестезии, ущипнув каждую из лап животного и ища отсутствие реакции отмены.
- С помощью лезвия скальпеля #11 сделайте разрез длиной около 3 см на коже по средней линии от L2 до L6.
- Отделите кожу от мышцы, вставив стерильные изогнутые хирургические ножницы между мышцей и кожей, а затем раскройте кончики.
- Удалите фасцию, покрывающую остистые отростки L2-L5.
6. Загрузка шприца
- Пипеткой внесите 25-35 мкл вектора (для достижения нужной дозы) в колпачок стерильной микроцентрифужной пробирки.
- Наберите весь объем в инсулиновый шприц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы во время этого процесса не набирался воздух.
7. Выполнение инъекции
- Определите остистые отростки L5 и L4.
Примечание: L6 находится непосредственно между двумя гребнями подвздошной кости, и его остистый отросток должен быть легко идентифицирован путем зондирования тупым инструментом. Затем инструмент можно аккуратно провести вверх по задней панели, чтобы найти границы процессов L5 и L4. - Положите одну руку так, чтобы большой палец мягко лег на хвост животного, а другую ногу положите на него. С помощью пальца закрепите шприц.
- Расположите иглу шприца так, чтобы она находилась слева от остистого отростка L5 и выровнялась с его хвостовым концом. Расположите шприц так, чтобы он находился примерно на 30° от средней линии и на 30° вверх от плоскости стола.
ПРИМЕЧАНИЕ: Может быть полезно использовать хирургический микроскоп для лучшего определения ориентиров и позиционирования кончика иглы. - Продвиньте иглу шприца вперед примерно на 8 мм, через верхнюю часть пластинки L5, а затем под пластинку L4 в поясничный бачок, пока кость не будет поражена. Правильная постановка приведет к подергиванию ноги и/или хвоста, которое можно увидеть или почувствовать по большому пальцу, лежащему на ноге/хвосте. Если подергивания нет, извлеките иглу и попробуйте провести процедуру с левой стороны. Если подергивания по-прежнему нет, при необходимости повторите процедуру между L4/L3 и L3/L2.
- Медленно нажмите на поршень в течение примерно 5 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время инъекции может наблюдаться подергивание ноги или хвоста. - Удерживайте шприц на месте в течение примерно 30 с после полного нажатия на поршень, чтобы обеспечить равновесие давления и свести к минимуму рефлюкс инъекции при извлечении иглы.
- Медленно извлеките иглу.
8. Закрытие разреза
- Приблизьтесь к краям разреза.
- Начиная с одного конца раны, используйте шов 4-0 (см. Таблицу материалов) или хирургические скобки, чтобы закрыть разрез.
9. Восстановление и мониторинг
- Поместите животное в заранее разогретую клетку.
- Проверяйте животное не реже одного раза в 15 минут до тех пор, пока оно не станет полностью амбулаторным.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно занять от 15 до 45 минут. - В течение следующих трех дней проводите проверки состояния здоровья не реже одного раза в день. Предоставляйте анальгетики в течение первых 2 дней после операции или в соответствии с требованиями IACUC.
- Через неделю после операции снимите швы или скобы.
10. Порядок последующих действий
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы определить точность техники инъекции, введите трипановый синий краситель, как описано выше, а затем немедленно усыпьте животное (следуя утвержденным в учреждении протоколам) и выполните ламинэктомию для визуализации результата.
- Пока животное остается под наркозом, усыпьте его, введя смертельную дозу пентобарбитала через внутрибрюшинную инъекцию в дозе 150 мг/кг.
- Как только дыхание и сердечная деятельность прекратятся, откройте грудную полость, чтобы обеспечить смерть. Продлите хирургический разрез вверх по задней части к шее.
- Сделайте надрез длиной 4 см в мышце, параллельной позвоночнику, с обеих сторон остистых отростков, держа как можно ближе к отросткам.
- С помощью тонких щипцов или ножниц удалите мышцу между остистыми отростками.
- Удалите остистые отростки от L6 до нижнегрудного отдела позвоночника с помощью ронжера (см. Таблицу материалов). Избегайте скручивающих движений, так как это может повредить ронжеры.
- Вставьте нижний кончик ронжера под пластинку L5 и удалите кость, лежащую над спинным мозгом, вынув из нее несколько «откусов».
ПРИМЕЧАНИЕ: Оттягивание остистого отростка L6 может облегчить введение кончика ронжера. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не допустить повреждения спинного мозга. - Продолжайте расширять ламинэктомию по крайней мере на четыре пластинки рострально. Осмотрите внутреннюю поверхность пластинок на наличие признаков красителя, которые могут свидетельствовать о неудачной инъекции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы определить точность техники инъекции, в качестве суррогата терапевтического препарата был использован краситель трипановый синий. Этот краситель легко связывается с белками, поэтому он обычно остается в структуре, в которую был введен. Это означает, что краситель может неточно предсказать распределение терапевтического средства после инъекции; Он просто используется для выявления точности инъекции. При удачном введении в поясничный отдел трипан синий связывается с твердой мозговой оболочкой, окрашивая периметр спинного мозга в синий цвет. Однако, когда игле не удается проникнуть в твердую мозговую оболочку, краситель оказывается в эпидуральном пространстве. Как твердая мозговая оболочка, так и окружающие ткани (поверхность кости и связки и мышцы, соединяющие пластинки) окрашиваются в синий цвет. Эти узоры легко заметны невооруженным глазом.
Разницу между правильно и неправильно введенной инъекцией трудно оценить, если просто сделать поперечный разрез через спинной мозг и позвоночный столб. Вместо этого рекомендуется выполнить ламинэктомию с использованием пары ронжеров, начиная с пластинки L5 и двигаясь рострально. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не повредить твердую мозговую оболочку в процессе. Использование препарирующего микроскопа облегчает этот процесс. На рисунке 1 приведены сравнительные примеры успешных инъекций и лишь частично успешных инъекций. При успешной инъекции при извлечении иглы практически не наблюдается рефлюкса вдоль траектории иглы. После успешной инъекции при удалении пластинки для обнажения спинного мозга трипановый синий цвет обнаруживается в спинном мозге, но не на поверхности кости (Рисунок 1A). Краситель также виден на стволе мозга и мозжечке после успешной инъекции (Рисунок 1B). Напротив, о частичной успешной инъекции свидетельствует значительный рефлюкс красителя обратно по игольчатому тракту в процессе инъекции и/или видимые признаки присутствия красителя на кости (Рисунок 1C).
Используя описанную выше процедуру, 28 мкл вектора AAV9, экспрессирующего усиленный зеленый флуоресцентный белок (GFP), вводили в концентрации 3 x10 13 векторных геномов/мл, что в сумме составило 8,4 x 1011 векторных геномов на животное. Через четыре недели животных усыпили и перфузировали 4% параформальдегидом10. Затем головной и спинной мозг были собраны и подготовлены к замораживанию разреза. Были получены срезы толщиной 40 мкм и окрашены для GFP. На рисунке 2 приведены примеры диаграммы направленности, полученной с помощью этого вектора. Трансдукция, как правило, была самой высокой в спинном мозге, особенно в поясничной области (рис. 2A-C), вероятно, из-за близости к месту инъекции. Трансдукция головного мозга была достигнута (рисунок 2D-F), но, как и ожидалось, она, как правило, была более ограниченной, чем то, что наблюдалось в спинном мозге.
Чтобы проиллюстрировать воспроизводимость результатов, достигнутых одним опытным хирургом с использованием одной партии вируса, окрашенные участки мозжечка и коры головного мозга у каждой из 15 крыс, введенных для этого исследования, представлены на рисунках 3 и 4 соответственно. Окрашенные участки шейного отдела спинного мозга также представлены у 7 из этих 15 крыс (Рисунок 5). Конечно, количество трансдукции мозга может показывать еще большую вариабельность при различных дозах, векторных партиях ихирургах.
Рисунок 1: Обнажение спинного мозга после инъекции красителя. Ламинэктомия выполнялась после введения трипанового синего. (А) Спинной мозг окрашивается в синий цвет при правильно введенной инъекции, и на кости, удаленной во время ламинэктомии, не видно красителя (стрелки). (B) Краситель также может наблюдаться вокруг ствола мозга. (C) При инъекции, при которой во время инъекции наблюдался значительный рефлюкс, в спинном мозге содержится меньше красителя, а на поверхности кости (стрелки) присутствует краситель. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: Примеры паттернов трансдукции, полученных после интратекальной доставки AAV9-GFP. Участки (А) шейного, (В) грудного и (В) поясничного отделов спинного мозга толщиной 40 мкм были иммуногистохимически окрашены на GFP (черное окрашивание). Высокие уровни трансдукции серого вещества наблюдались на всех уровнях. (D) Напротив, мозг демонстрирует более редкую общую трансдукцию. Левый и правый прямоугольники увеличены в точках (E) и (F) соответственно. (E) Большая часть окрашивания наблюдается в мозжечке, в первую очередь в нейронах Пуркинье (стрелках). (F) Нейроны (стрелки) и астроциты (наконечники стрел) трансдуцируются в коре головного мозга. Масштабные линейки: (A-C) 325 μм; (D) 5 мм; и (E,F) 200 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Воспроизводимость трансдукции в мозжечке. Воспроизводимость трансдукции в мозжечок 15 крыс, введенных одним и тем же хирургом с использованием той же дозы и партии вируса. Масштабная линейка: 1 мм. Цифры на изображениях указывают на идентификационные номера крыс («помет»). индивидуальный»). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4: Воспроизводимость трансдукции в коре головного мозга. Воспроизводимость трансдукции в кору головного мозга 15 крыс, введенных одним и тем же хирургом с использованием той же дозы и количества вируса. Масштабная линейка: 500 μм. Цифры на изображениях указывают на идентификационные номера крыс («помет»). индивидуальный»). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 5: Воспроизводимость трансдукции в шейном отделе спинного мозга. Воспроизводимость трансдукции в шейный отдел спинного мозга 7 крыс, введенных одним и тем же хирургом с использованием той же дозы и партии вируса. Масштабная линейка: 500 μм. Цифры на изображениях указывают на идентификационные номера крыс («помет»). индивидуальный»). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Самые разнообразные заболевания поражают ЦНС. Предоставление функциональной копии соответствующего гена с помощью вирусного вектора является привлекательной стратегией лечения рецессивных и моногенных заболеваний, таких как спинальная мышечная атрофия. Тем не менее, гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) исключает большинство векторов генной терапии, вводимых внутривенно11. Те из них, которые могут проникать через ГЭБ, такие как AAV9, должны вводиться в высоких дозах, чтобы компенсировать потерю вектора из-за периферической трансдукции12. Возраст также является барьером. Воздействие различных серотипов AAV из окружающей среды увеличивается с возрастом13 лет и часто приводит к выработке антител, которые могут нейтрализовать терапевтические векторы14. Таким образом, внутривенная доставка векторов генной терапии при заболеваниях ЦНС, как правило, ограничена младенцами и не используется у пациентов, диагностированных в более позднем возрасте.
У пациентов пожилого возраста прямое введение вектора в спинномозговую жидкость может привести к широкой трансдукции в ЦНС, минуя как ГЭБ, так и ранее существовавшие антитела к AAV. Поскольку этот подход является таргетным, можно также использовать более низкие векторные дозы. Существует два основных подхода в клинических условиях: (1) люмбальная пункция и (2) инъекция в боковые желудочки. Последний несет в себе больший риск, но в целом обеспечивает большую трансдукцию мозга. Люмбальная пункция более безопасна, но трансдукция смещена в сторону спинного мозга. Трансдукцию мозга можно было бы усилить, поместив пациента в положение Тренделенбурга, но данные по этому поводу неоднозначны16,17. Использование катетера для доступа к большой цистерне с помощью люмбальной пункции может быть лучшим вариантом в клинике, но он находится на ранней стадии использования5. Могут возникнуть и другие трудности с переносом подходов, разработанных на животных моделях, в клинику, такие как потеря вектора из-за утечки спинномозговой жидкости18 и токсичность в ганглиях дорсального корешка19.
В большинстве исследований ЦНС-направленной терапии, проводимой на грызунах, использовались новорожденные или взрослые животные (в возрасте >60 дней). Неонаты имеют преимущество в виде небольшого размера тела, что позволяет получать более высокие эффективные дозы, и незрелой иммунной системы, что позволяет избежать осложнений иммунного ответа против терапевтических средств. Тем не менее, с точки зрения развития мозга, новорожденная мышь или крыса лучше представляет эмбриональную стадию у человека. Для терапии, предназначенной для детей в возрасте 5-10 лет, молодая крыса (в возрасте 25-35 дней) является лучшей моделью с точки зрения неврологическогоразвития. Поскольку метод интратекального введения ранее не был описан для молодых крыс, а методы, разработанные для взрослых мышей и крыс, оказались неэффективными у крыс в этом возрасте, был разработан описанный выше подход. Чтобы внести ясность, молодые крысы не только меньше взрослых, но и могут отличаться эластичностью твердой мозговой оболочки, которая защищает спинной мозг, что делает процедуру, которая работает для прокола этого слоя у взрослой крысы, неэффективной у молодой.
При изучении того, как проводить интратекальную инъекцию молодым крысам, необходимо использовать краситель (например, трипановый синий) в качестве суррогата терапевтического препарата, и пользователь должен быть очень уверен в своей способности успешно и воспроизводимо выполнить процедуру до начала исследования с терапевтическим средством. Чтобы овладеть этой техникой, потребуется практика, чтобы получить опыт работы со шприцем, когда траектория направлена в цель, а не в цель. Есть две распространенные ошибки. Если угол подхода слишком мал, игла будет ударяться о верхнюю часть одной из пластинок или заднюю часть ростральной пластинки. Подергивания не будет, а расстояние, на которое игла продвигается, будет на несколько миллиметров меньше 8 мм. Если угол входа слишком велик, есть риск, что игла пройдет между двумя пластинками и проникнет в брюшную полость. Когда это произойдет, игла будет продвигаться гораздо дальше, чем на 8 мм. Если это произошло, извлеките иглу, измените положение и повторите попытку. В тех немногих случаях, когда это происходило, временное попадание в брюшную полость за несколько миллиметров до изъятия и изменения положения не причиняло животным какого-либо видимого длительного вреда.
Было обнаружено, что наблюдение за физической реакцией на установку иглы имеет решающее значение для достижения воспроизводимости с высокой вероятностью успеха при этой процедуре. Когда ответа не было, вероятность успеха инъекции была низкой. Тем не менее, в некоторых случаях животному требовались попытки в нескольких местах для достижения ответа, и следовые количества красителя наблюдались в одном или нескольких предыдущих следах иглы. В эпидуральном пространстве не наблюдалось красителя, что позволяет предположить, что некоторые из предыдущих уколов иглой проникли в твердую мозговую оболочку, не вызвав подергивания хвоста или ноги. Поскольку рефлюкс был минимальным (подобно тому, что наблюдается в траектории иглы от инъекции), считается, что влияние предыдущих уколов иглой на эффективность доставки в этих случаях было незначительным.
Как только человек достигает мастерства в технике родоразрешения, он может столкнуться со второй, нехирургической проблемой. В частности, у взрослых крыс (в возрасте ~70 дней) активность векторов AAV9 для интратекальной доставки в спинной и головной мозг может существенно варьироваться от партии к партии, даже если они генерируются одним и тем же векторным ядром. Некоторые партии будут работать так, как ожидалось, приводя к трансдукции в сером веществе спинного мозга по всей его длине. Другие, однако, не смогут проникнуть через серое вещество, в первую очередь трансдуцируя ганглии10 дорсальных корешков. Причина такой вариабельности неясна, так как векторы являются мощными in vitro и при введении непосредственно в спинной мозг. Перед началом крупного исследования рекомендуется провести пилотное исследование на 3-4 животных с любой новой партией вируса, чтобы подтвердить, что новая партия работает так, как ожидалось. Активность может быть оценена с помощью иммуногистохимического или иммунофлуоресцентного окрашивания белкового трансгенного продукта или количественного определения количества трансгенной мРНК или векторных геномов с помощью количественной ПЦР или ddPCR21. В дополнение к неизвестным переменным, которые отличают партии вирусов, небольшие различия в возрасте животных, объеме инъекции, скорости доставки и концентрации вектора могут вызывать вариабельность результатов. Прежде чем начать крупное исследование, их может потребоваться оптимизировать для каждого вируса или другого потенциального терапевтического агента.
После обучения опытный хирург может завершить процедуру интратекальной инъекции молодой крысы примерно за 30 минут, от индукции анестезии до начала восстановительного периода. Это позволяет лечить большие когорты за короткий промежуток времени. Восстановление после операции также происходит быстро. Большинство животных нормально передвигаются в течение 20-30 минут. После проведения более 200 таких операций никаких побочных эффектов от этой процедуры не наблюдалось.
Наконец, сведение к минимуму страданий животных и обеспечение благополучия животных во время хирургических процедур являются первостепенными соображениями. Таким образом, требуется правильное использование анестетиков и анальгетиков, а также необходимо поддерживать температуру тела во время процедуры и до полного восстановления животного после анестезии. У соответствующих контролирующих органов и ветеринарного персонала в разных учреждениях могут быть разные требования и рекомендации по этим темам. Применение анестетиков и анальгетиков, описанных в этой процедуре, было разработано в консультации с ветеринарами Университета Эмори и персоналом IACUC. Исследователи должны тесно сотрудничать со своими местными ветеринарами и IACUC для достижения необходимых целей.
Существуют определенные ограничения для этой процедуры. Описанный здесь метод был разработан для использования на молодых крысах, и мириады структурных и других различий между людьми и крысами могут ограничивать трансляцию этих процедур на людей. Целью обеспечения возможности интратекальной инъекции терапевтического препарата в поясничном отделе у молодых крыс является облегчение использования модели молодых крыс для проверки эффективности потенциального терапевтического лечения, даже если точный способ доставки должен быть изменен для применения у пациентов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Д-р Донсанте является изобретателем по находящемуся на рассмотрении патенту на введение в спинномозговую жидкость векторов AAV9.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Стивена Грея, Мэтью Риу, Нанду Регми и Лейси Стирман из Юго-Западного университета Техаса за продуктивное обсуждение проблемы, которую представляют молодые крысы при интратекальной инъекции. Эта работа была частично поддержана финансированием от Jaguar Gene Therapy (JLFK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 µL filtered pipette tips | MidSci | PR-200RK-FL | Pipetting virus |
| AAV9-GFP | Vector Builder | P200624-1005ynr | AAV9 vector expressing GFP |
| Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 Braided | McKesson | J422H | Suture |
| Bench pad | VWR | 56616-031 | Surgery |
| Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8'' | Fisher Scientific | 50-195-4664 | Maintains body temperature |
| Buprenorphine | McKesson | 1013922 | Analgesic |
| Buprenorphine-ER (1 mg/mL) | Zoopharma | Extended-release analgesic | |
| Cotton swabs | Fisher Scientific | 19-365-409 | Blood removal |
| Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration | Steris | 1212CPSTF | Surgical drape |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Forceps |
| Electric Blanket | CVS Health | CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad | |
| Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL | Eppendorf | 3123000055 | Pipetting virus |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | Curved surgical scissors |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | Laminectomy |
| Halsey Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | Needle driver |
| Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc | BD | 328431 | Syringe |
| Isoflurane | McKesson | 803250 | Anesthetic |
| Isopropanol wipes | Fisher Scientific | 22-031-350 | Skin disinfection |
| Lidocaine, 1% | McKesson | 239935 | Local anesthesia |
| Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-137 | Loading the syringe |
| Povidone-iodine | Fisher Scientific | 50-118-0481 | Skin disinfection |
| Scalpel Handle - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Scalpel blade holder |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific | EZ-17 | Anesthesia box |
| Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped | McKesson | 4-111 | #11 Scalpel blade |
| SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment | Alcon | Eye ointment | |
| Trypan Blue | VWR | 97063-702 | Injection |
References
- Wurster, C., Petri, S. Progress in spinal muscular atrophy research. Curr Opin Neurol. 35 (5), 693-698 (2022).
- Wu, K. Y., et al. Retinitis pigmentosa: Novel therapeutic targets and drug development. Pharmaceutics. 15 (2), 685 (2023).
- Larkin, H. First FDA-approved gene therapy for hemophilia. JAMA. 329 (1), 14 (2023).
- Lee, A.
- Taghian, T., et al. A safe and reliable technique for CNS delivery of AAV vectors in the cisterna magna. Mol Ther. 28 (2), 411-421 (2020).
- Donsante, A., et al. Intracerebroventricular delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the adult rat brain. Gene Ther. 23 (5), 401-407 (2016).
- Pellot, J. E., Jesus, O. D. Suboccipital puncture. [Updated 2022 Jul 25]. StatPearls [Internet]. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2022).
- Elliger, S. S., Elliger, C. A., Aguilar, C. P., Raju, N. R., Watson, G. L. Elimination of lysosomal storage in brains of MPS vii mice treated by intrathecal administration of an adeno-associated virus vector. Gene Ther. 6 (6), 1175-1178 (1999).
- De La Calle, J. L., Paino, C. L. A procedure for direct lumbar puncture in rats. Brain Res Bull. 59 (3), 245-250 (2002).
- O'connor, D. M., Lutomski, C., Jarrold, M. F., Boulis, N. M., Donsante, A. Lot-to-lot variation in adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) preparations. Hum Gene Ther Methods. 30 (6), 214-225 (2019).
- Manfredsson, F. P., Rising, A. C., Mandel, R. J. AAV9: A potential blood-brain barrier buster. Mol Ther. 17 (3), 403-405 (2009).
- Hudry, E., Vandenberghe, L. H. Therapeutic AAV gene transfer to the nervous system: A clinical reality. Neuron. 101 (5), 839-862 (2019).
- Georg-Fries, B., Biederlack, S., Wolf, J., Zur Hausen, H. Analysis of proteins, helper dependence, and seroepidemiology of a new human parvovirus. Virology. 134 (1), 64-71 (1984).
- Schulz, M., et al. Binding and neutralizing anti-aav antibodies: Detection and implications for rAAV-mediated gene therapy. Mol Ther. 31 (3), 616-630 (2023).
- Gray, S. J., Nagabhushan Kalburgi, S., Mccown, T. J., Samulski, J. R. Global CNS gene delivery and evasion of anti-aav-neutralizing antibodies by intrathecal aav administration in non-human primates. Gene Ther. 20 (4), 450-459 (2013).
- Meyer, K., et al. Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for sma: A dose-response study in mice and non-human primates. Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).
- Hinderer, C., et al. Evaluation of intrathecal routes of administration for adeno-associated viral vectors in large animals. Hum Gene Ther. 29 (1), 15-24 (2018).
- Wang, Y. F., et al. Cerebrospinal fluid leakage and headache after lumbar puncture: A prospective non-invasive imaging study. Brain. 138, 1492-1498 (2015).
- Hordeaux, J., et al. Adeno-associated virus-induced dorsal root ganglion pathology). Hum Gene Ther. 31 (15-16), 808-818 (2020).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106-107, 1-16 (2013).
- Fang, H., et al. Comparison of adeno-associated virus serotypes and delivery methods for cardiac gene transfer. Hum Gene Ther Methods. 23 (4), 234-241 (2012).
