Summary
Her giver vi en praktisk procedure til dissekering og udførelse af histologiske og genekspressionsanalyser af murin supraklavikulært brunt fedtvæv.
Abstract
Brunt fedtvæv (BAT)-medieret termogenese spiller en vigtig rolle i reguleringen af stofskiftet, og dets morfologi og funktion kan i høj grad påvirkes af miljømæssige stimuli hos mus og mennesker. I øjeblikket er murine interscapular BAT (iBAT), som er placeret mellem to scapulae i musens øvre dorsale flanke, det vigtigste BAT-depot, der anvendes af forskningslaboratorier til at studere BAT-funktion. For nylig blev nogle få tidligere ukendte BAT-depoter identificeret hos mus, herunder et analogt med humant supraklavikulært brunt fedtvæv. I modsætning til iBAT er murin supraklavikulært brunt fedtvæv (scBAT) placeret i det mellemliggende lag af halsen og kan derfor ikke tilgås så let.
For at lette undersøgelsen af nyligt identificeret musescBAT er der heri en protokol, der beskriver trinene til at dissekere intakt scBAT fra postnatale og voksne mus. På grund af scBATs lille størrelse i forhold til andre fedtdepoter er procedurer blevet ændret og optimeret specifikt til behandling af scBAT. Blandt disse modifikationer er brugen af et dissekerende mikroskop under vævsindsamling for at øge præcisionen og homogeniseringen af frosne scBAT-prøver for at øge effektiviteten af efterfølgende qPCR-analyse. Med disse optimeringer kan identifikationen af, morfologisk udseende af og molekylær karakterisering af scBAT bestemmes hos mus.
Introduction
Den stigende forekomst af fedme i USA og på verdensplan har antændt stor interesse for at forstå dets ætiologi og identificere potentielle behandlinger 1,2. Fedtvæv spiller en afgørende rolle i stofskiftet, og dysregulering af fedtvævet kan føre til udvikling af fedme. Generelt er der to typer fedtvæv, hvidt og brunt fedtvæv. Mens hvidt fedtvæv (WAT) kan lagre kemisk energi og udskille endokrine faktorer, kan brunt fedtvæv (BAT) bruge kemisk energi til at generere varme og opretholde kropstemperaturen i kulden 3,4. På grund af denne unikke evne kan aktivering af BAT også øge energiforbruget og forbedre insulinfølsomheden5.
BAT udøver sin funktion gennem ikke-rystende termogenese, en proces medieret af afkobling af protein 1 (UCP1)6. Pattedyr, herunder mus og mennesker, besidder varierende mængder BAT. Den klassiske opfattelse af BAT er, at disse fedtvæv er mere rigelige hos mus og spædbørn end hos voksne mennesker. iBAT, der ligger i den øvre dorsale flanke mellem skulderbladene, er det mest undersøgte BAT-depot hos mus. Ved at anvende radioisotopbilleddannelse og biopsitest identificerede nylige undersøgelser flere BAT-depoter hos voksne mennesker. Nogle af dem, herunder depoterne fundet i den dybe hals og supraklavikulære region, var ikke tidligere blevet identificeret hos mus eller andre modeldyr 7,8,9,10,11. Blandt disse BAT-depoter er scBAT det hyppigst sete depot hos voksne mennesker. For bedre at forstå oprindelsen og det molekylære bidrag fra disse nyfundne BAT-depoter hos mennesker er det vigtigt at identificere ækvivalente depoter i mus, der gør det muligt for genetiske og molekylære manipulationer at spore og teste disse depoters funktionelle rolle. Således identificerede vi og andre nogle få tidligere ukendte BAT-depoter på forskellige anatomiske steder hos mus, herunder scBAT12,13, thorax perivaskulær BAT14,15, perirenal BAT16 og periaorta BAT17. Mus scBAT anatomisk ligner human scBAT og ligner morfologisk klassisk iBAT og udtrykker høje niveauer af UCP112.
I modsætning til musens iBAT, som let kan dissekeres, er scBAT placeret i det mellemliggende lag af musehalsen, under spytkirtlerne og langs den ydre halsvene. Isolering af dette depot til histologiske og molekylære analyser kan være udfordrende. Her beskriver vi detaljeret proceduren for dissekering af scBAT fra postnatale og voksne mus og behandling af dette depot til histologi og genekspressionsanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøgene blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Baylor College of Medicine. Alle procedurer blev udført på C57BL/6J hanmus i alderen 3 uger og 3 måneder gamle. Før dissektionen blev alle mus aflivet ved hjælp af den godkendte gnaver kuldioxid eutanasi procedure. Se materialefortegnelsen for detaljer vedrørende alle materialer, reagenser og instrumenter, der anvendes i denne protokol.
1. Dissektion af scBAT
- Placer musekroppen på arbejdsbordet, og rengør den kirurgiske saks og superfine spidstang med 70% ethanol.
- Spray musens ventrale hals med 70% ethanol for at våde pelsen og minimere pelsforurening.
- Lav et bilateralt snit, ca. 1,5 cm, langs kravebenet.
- Fra enderne af det foregående snit skæres i længderetningen mod ørerne, ca. 1 cm lange. Dette vil danne et firkantet U-formet snit omkring halsen (figur 1A, B).
BEMÆRK: scBAT ligger i det mellemliggende lag af nakken. Det overfladiske lag, der består af huden, subkutant fedtvæv og spytkirtler, udsættes under dette trin. Det mellemliggende lag indeholder sammen med scBAT jugularvenerne og nakkemusklerne. Det dybe lag af nakken, der indeholder dyb hals BAT og arterie- og jugularvener, udsættes ved at fjerne skeletmuskulaturen. - Placer musen under et dissekerende mikroskop og bring den blottede hals i fokus (figur 1C).
BEMÆRK: Dette tilføjede trin øger i høj grad præcisionen af vævsindsamling, hvilket er nødvendigt i betragtning af den lille størrelse af scBAT. - Udsæt spytkirtlerne fuldstændigt ved at løfte de indskårne hudsektioner væk med pincet.
- Brug kirurgisk saks og tang til at afbryde vævet, der forbinder spytkirtlerne med vævet omkring kravebenene og til hinanden.
- Udsæt scBAT-depoterne ved at løfte spytkirtlerne. Se efter BAT langs den ydre halsvene og muligvis forbundet med undersiden af spytkirtlerne. Identificer det ved sin orangiske farve, som skiller sig ud mod det omgivende væv.
- Hold målfedtvævet med tang og skræl det forsigtigt væk fra spytkirtlerne.
- Når scBAT er løsrevet fra spytkirtlerne, skal du fortsætte med at afbryde forbindelsen fra den ydre halsvene og nakkemuskulaturen, indtil depoterne på hver side af halsen kan fjernes hele.
- Undersøg hver dissekeret scBAT-prøve under dissekeringsmikroskopet (figur 1D, E) ved hjælp af tang for at fjerne eventuelt resterende bindevæv.
- Hver prøve anbringes i et hætteglas med glasscintillation indeholdende 10 ml fosfatbufret saltopløsning (PBS), og musen fjernes under mikroskopet.
2. Behandling og hæmatoxylin og eosin (H&E) farvning af scBAT (illustreret i figur 2A)
- Udskift PBS (trin 1.12) med 10 ml koldt 4% paraformaldehyd (PFA) og læg hætteglasset på en møtrik, der vippes ved 4 °C natten over for at fiksere scBAT.
BEMÆRK: Perfusionsfiksering kan anvendes til postnatale, især voksne mus, når yderligere behandling til immunhistokemisk analyse er nødvendig. - Næste dag tages PFA-opløsningen ud af hætteglasset med en steril overførselspipette og erstattes med 10-15 ml PBS. Placer hætteglasset på en møtrik, og sten i 30 minutter ved stuetemperatur. Udskift PBS med 0,85% saltopløsning og fortsæt med at rocke i yderligere 30 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Saltopløsningen er 0,85% saltvand (NaCl) w/v i DEPC-behandlet vand (RNase-fri). PBS kan erstatte saltopløsningen i dette og det følgende trin. - Fjern 0,85 % saltvand med en overførselspipette og tilsæt 10 ml 70 % ethanol/0,85 % saltopløsning til hætteglasset. Opbevar hætteglasset i et 4 °C køleskab natten over, eller indtil det er klar til paraffinindlejring.
BEMÆRK: PBS kan bruges, hvis 0,85% saltvand ikke er tilgængeligt. scBAT bør behandles så hurtigt som muligt for lettere sektionering og bedre bevaret vævsmorfologi. - Før paraffinindlejring dehydreres scBAT gennem en række ethanoludvekslinger for at fjerne vand fra vævet.
- Til at begynde med fjernes 70% ethanol/0,85% saltvand fra hætteglasset med en overførselspipette og tilsættes 10-15 ml 95% dehydrerende alkohol, og hætteglasset vippes på en møtrikator ved stuetemperatur i 1 time. Gentag dette trin én gang.
BEMÆRK: Ethanol kan anvendes i stedet for dehydrerende alkoholopløsninger. - Udskift derefter 95% dehydrantalkohol med 10-15 ml 100% dehydrantalkohol og fortsæt med at rocke på en møtriker i 1 time. Påfyld ny 100% dehydreret alkohol og fortsæt med at rokke i flere timer eller natten over, afhængigt af mængden af scBAT i hætteglasset.
- Til at begynde med fjernes 70% ethanol/0,85% saltvand fra hætteglasset med en overførselspipette og tilsættes 10-15 ml 95% dehydrerende alkohol, og hætteglasset vippes på en møtrikator ved stuetemperatur i 1 time. Gentag dette trin én gang.
- For at fjerne scBAT til indlejring tilsættes 10 ml toluen til hætteglasset, og der vippes videre på en møtrik, indtil scBAT er gennemsigtig, ca. 6-8 timer.
BEMÆRK: Den tid, det tager at opnå tilfredsstillende clearing, afhænger af scBAT'ens størrelse. Det anbefales at begynde at rydde straks om morgenen, så infiltration og indlejring kan finde sted om eftermiddagen. - For at indlejre scBAT i paraffinvoks fjernes toluen, og der tilsættes 10 ml smeltet infiltrationsparaffinvoks til hætteglasset. Sæt hætteglasset i en ovn ved 65 °C i 1 time. Gentag dette trin med ny voks.
BEMÆRK: Begynd at smelte vokspiller i en ovn natten over, før indlejringen begynder for at sikre, at voksen er helt flydende. - Udskift infiltrationsparaffinvoks med indlejret paraffinvoks og anbring hætteglasset ved samme temperatur i 1 time. Gentag dette trin én gang.
BEMÆRK: Infiltrationsfasen kan afbrydes og fortsættes senere. Tag hætteglasset ud af ovnen og opbevar det ved stuetemperatur, indtil det er klar til at fortsætte. - Integrer vævet ved først at placere det i en vævsindlejringsform, tilsæt smeltet indlejringsvoks til formen og omorienter vævet under et stereomikroskop. Placer derefter en indlejringskassette oven på voksen og fortsæt med at hælde indlejringsvoks over toppen af den, indtil den er fuld, og indlejringshætten er fastgjort til voksblokken. Overfør blokken til et 4 ° C køleskab natten over for at lade voksen stivne og krympe, før metalformen fjernes.
- Skær scBAT med et mikrotomt til en tykkelse på 5-6 μm18, tre til fire sektioner pr. mikroskopglas, og anbring det i et varmt flydebad i paraffinsektion ved ~42 °C for at lade vævssektionerne glatte ud.
- Overfør sektionerne til dias, og placer gliderne lodret mod flydebadet for at lade vand dryppe af diasene.
- Overfør diasene til et rustfrit farvningsstativ, og læg stativet på en glidetørrebænk for at tørre natten over.
BEMÆRK: Paraffinobjektglassene kan opbevares på lang sigt ved stuetemperatur, inden yderligere behandling opnås. - Udfør H&E-farvning19. Til at begynde med skal du placere diasene i et farvningsstativ og derefter placere stativet i en farvningsbeholder med xylen i 40 s. Gentag dette trin én gang.
BEMÆRK: Hvis paraffin stadig er synligt efter de to trin, skal du vente, indtil det er helt opløst, før du fortsætter. - For at rehydrere vævet skal du placere glidestativet i en farvningsbeholder fyldt med 100% dehydrerende alkohol i to 20 s trin, efterfulgt af et 15 s trin i 95% dehydrerende alkohol og en sidste 15 s skylning i ddH2O.
- Anbring diasene i en farvningsskål fyldt med hæmatoxylinopløsning i 75 s for at opnå nuklear farvning, skyl derefter diasene i en farvningsskål med ddH2O i 45 s.
BEMÆRK: Tiden kan justeres afhængigt af den ønskede pletfarve. - Differentier farvningen ved at dyppe dias i en farvningsskål fyldt med HCI-ethanolopløsning i 15 s, og overfør derefter dias til en anden ddH2O-skylning i 15 s.
BEMÆRK: HCl-ethanolopløsningen fremstilles efter en offentliggjort metode19. - Til cytoplasmatisk farvning anbringes objektglasset i en Eosin Y-modpletopløsning i 15 sekunder.
- Dehydrer vævet ved at dyppe diasene i 15 s hver i tre sekventielle 95% dehydrantalkoholopløsningstrin, derefter to sekventielle 100% dehydrantalkoholbade - det første i 15 s og det andet i 45 s - for at afslutte dehydrering.
- Overfør til sidst diasene til et xylenbad i 45 s for at reakklimatisere vævet til organiske opløsningsmidler. Efter dette trin er farvningen afsluttet; Fjern vævet fra opløsningen.
- Påfør monteringsmediet på hvert objektglas og dæksel det inde i en kemisk stinkhætte. Tør natten over før billeddannelse. Billeddiagnostiske resultater er vist i figur 2B.
3. Genekspressionsanalyse af scBAT
- Vævsopsamling (slibning)
- Efter dissekering af scBAT skal du straks sætte vævet i et mikrocentrifugerør, stikke et hul i toppen af røret med en steril nål og snapfryse i flydende nitrogen.
BEMÆRK: De vigtigste trin i protokollen, der er skitseret her, er illustreret i figur 3A. At stikke et hul i toppen af røret, før det tabes i flydende nitrogen, forhindrer røret i at sprænge på grund af den pludselige trykændring. - Fyld et plastikbæger med flydende nitrogen og lad en stød og tynd spatel suge.
BEMÆRK: Det er vigtigt at holde temperaturen på alle værktøjer og vævsprøver så kold som muligt, tæt på temperaturen af flydende nitrogen, under hele proceduren for at forhindre vævet i at tø op. Optøet fedtvæv er meget klæbende og gør pulveriseringen mere udfordrende. Fjern kun værktøj og prøver fra flydende nitrogenbad umiddelbart før brug. - Tag en snapfrosset vævsprøve ad gangen og hæld den fra mikrocentrifugerøret i mørtel.
- Tilsæt en lille mængde flydende nitrogen til mørtel, og brug derefter støderen til at male det frosne væv, indtil det er helt pulveriseret.
BEMÆRK: Hvis vævet begynder at blive blødt eller klæbrigt på noget tidspunkt, tøer det op; Hæld mere flydende nitrogen i mørtel. - Brug den tynde spatel til forsigtigt at skrabe og overføre det pulveriserede væv tilbage til mikrocentrifugerøret. Hæld flydende nitrogen i mørtel, mens du skraber for at samle rester af væv, inden du overfører med en spatel. Gentag overførselstrinnene, indtil alt væv er fjernet fra mørtel.
- Rengør mørtlen med en let vævsvisker og 70% ethanol, inden den næste prøve dumpes. Opbevar pulverservietten i en -80 °C fryser på lang sigt.
- Efter dissekering af scBAT skal du straks sætte vævet i et mikrocentrifugerør, stikke et hul i toppen af røret med en steril nål og snapfryse i flydende nitrogen.
- Total RNA-isolering
- Præparation
- Rengør arbejdsbordet, pipetterne, spidsholderne og rørstativerne med både 70 % ethanol og overfladedekontaminant for at fjerne RNase.
- Centrifugemaskinen køres op til 4 °C.
- Elueringsopløsningen opvarmes til 70 °C.
- DNase I fortyndes ved at blande 5 μL rekonstitueret DNase I med 75 μL DNase-fortyndingsopløsning pr. prøve. DNase I-opløsningen lægges på is indtil brug.
- Procedure
- For hver prøve mærkes to mikrocentrifugeglas, to kolonneholderør (to hætteløse graduerede mikrocentrifugeglas) og en bindende minikolonne.
- Tilsæt 500 μL RNA-isolationsopløsning til hver prøve og soniker ved hjælp af en pelletpestlemotor i 30 s.
- Få en sprøjte til hver prøve og pipet op og ned 10x for yderligere at lyse vævet. Sørg for, at der ikke er synlige faste stoffer efter sprøjtning.
- Tilsæt 250 μL chloroform og hvirvel lejlighedsvis, mens du venter 5 minutter på, at prøverne inkuberes ved stuetemperatur.
- Der centrifugeres ved 21.000 × g i 20 minutter ved 4 °C.
- Den øverste vandige del overføres til et nyt mikrocentrifugerør og tilsættes en tilsvarende mængde 70% ethanol (~500 μL).
BEMÆRK: Den øverste vandige del skal være klar, bunden skal være den røde RNA-isolationsopløsning, og mellem de to lag skal der være nogle uønskede faste stoffer. - 500 μL af det nye lysat overføres til bindingskolonnen. Der centrifugeres ved 18.000 × g i 60 sek., og filtratet kasseres derefter.
- Gentag det forrige trin med det resterende lysat for at få alt RNA ind i bindingskolonnen.
- Der tilsættes 700 μL vask med lav strenghed til bindingskolonnen, centrifugeres i 30 s, og filtratet kasseres.
- Der tilsættes 80 μL fortyndet DNase I til hver bindingskolonne. Inkuber i 15 min ved stuetemperatur.
- Der tilsættes 700 μL vask med høj strenghed, centrifugeres i 30 sekunder, og filtratet kasseres.
- Der tilsættes 700 μL vask med lav strenghed, centrifugeres i 60 sekunder, og filtratet kasseres.
- Flyt bindingskolonnerne ind i den 2. nye hætteløse kolonne, der holder røret, og centrifuger i 2 minutter for at sikre, at alle væsker fjernes fra bindingskolonnen.
- Flyt bindingskolonnerne til et nyt mikrocentrifugerør, og tilsæt 30 μL opvarmet elueringsopløsning. Inkuber ved stuetemperatur i 1 min.
- Centrifuger i 2 minutter for at opsamle det eluerede RNA i bunden af mikrocentrifugerøret.
- Mål den totale RNA-koncentration ved hjælp af et spektrofotometer.
BEMÆRK: Hvis den totale RNA-renhed er lav, angivet med en 260/280-værdi under 2,0 eller 260/230-værdi under 1,8, kan prøverne efter trin 3.2.2.12. vaskes igen med vask med lav strenghed efterfulgt af vask med 80% ethanol, før trin 3.2.2.13 fortsættes. - Opbevar RNA'et i en -80 °C fryser.
- Omvendt transkription (RT)
- I en PCR-rørstrimmel tilsættes 0,5-1 μg total RNA fortyndet i DEPC-behandlet vand til i alt 8 μL for hver RNA-prøve til en anden brønd.
BEMÆRK: Mængden af RNA, der anvendes til revers transkription, kan skaleres op eller ned i henhold til producentens anvisninger. - Der tilsættes 1 μL Oligo dT og 1 μL dNTP'er til hver prøve i PCR-reagensglasset. Sørg for, at det samlede volumen er 10 μL pr. prøve.
- Anbring PCR-rørstrimlen i en termocyklist, og indstil den til 65 °C i 5 minutter efterfulgt af 4 °C på ubestemt tid.
- Efter 5 minutter ved 65 °C tages PCR-rørstrimlen ud og lægges på is i mindst 2 min. Efter inkubation på is tilsættes fem reagenser: 4 μL 5x førstestrengsbuffer, 2 μL 25 mMMgCl2, 2 μL 0,1 M DTT, 1 μL RNasehæmmer og 1 μL revers transkriptase til hver prøve. Sørg for, at det samlede volumen nu er 20 μL pr. prøve.
- Sæt PCR-rørstrimlen tilbage i termocyklisten, og indstil programmet til 50 °C i 50 minutter, derefter 85 °C i 5 minutter og derefter 4 °C på ubestemt tid.
- Når programmet når 4 °C, tages strimlen ud og tilsættes 1 μL ribonuklease H (RNase H).
BEMÆRK: RNase H bruges til at fjerne enhver resterende RNA-skabelon i RT-reaktionen; ved dette trin skal det ønskede RNA allerede omdannes til cDNA. - Sæt strimlen tilbage i termocyklisten og kør 37 °C i 20 minutter og derefter 4 °C på ubestemt tid.
- Omvendt transkription er komplet; måle cDNA-koncentration ved hjælp af et spektrofotometer.
- cDNA'et fortyndes til 250 ng/μL; opbevar cDNA'et i enten en fryser med -80 °C eller -20 °C.
- I en PCR-rørstrimmel tilsættes 0,5-1 μg total RNA fortyndet i DEPC-behandlet vand til i alt 8 μL for hver RNA-prøve til en anden brønd.
- Kvantitativ PCR (qPCR)
- Lav et regneark for at organisere placeringen af hver primer og prøve på 96-brønds qPCR-pladen.
BEMÆRK: En af primerne skal være et referencegen for at normalisere ekspressionen af alle andre gener af interesse, såsom 36B4. - Lav en primer master mix for hver "primer + prøve" kombination. Til hver qPCR-reaktionsbrønd tilsættes 3 μL molekylærbiologisk vand, 5 μL qPCR-enzymmasterblanding, 0,5 μL fremadgående primer og 0,5 μL omvendt primer, hvilket tilføjer op til 9 μL pr. Reaktion. Der tilsættes 1 μL cDNA pr. reaktion for at opnå i alt 10 μL pr. reaktionsbrønd.
BEMÆRK: Standarden er at have tre tekniske replikater for hver "primer + prøve" kombination, så hver masterblanding skal være 4x af ovenstående mængder. - Tilsæt 1 μL cDNA for hver replikat til hver primermasterblanding. Hvis hver masterblanding er 4x, pipetteres 4 μL af hver prøve cDNA i deres eget mærkede rør.
- Endelig pipet 10 μL af hver reaktion blandes ind i 96-brønds qPCR-pladen i de positioner, der bestemmes af regnearket.
- Pladen forsegles med en tyk klæbeforsegling, og derefter centrifugeres 96-brøndpladen ved 450 × g ved 20 °C i 2 minutter.
BEMÆRK: Det er vigtigt, at pladen er helt forseglet for at undgå, at prøver fordamper under termocykling. Brug lette vævsviskere til at trykke tætningen ned på pladen, især kanterne. - Kør pladen i et PCR-instrument i realtid. PCR-reaktionen programmeres i henhold til producentens anvisninger: 2 minutter ved 50 °C, efterfulgt af yderligere 2 minutter ved 95 °C og endelig 40 cyklusser med 15 s ved 95 °C og 30 s ved 60 °C. Resultaterne af qPCR-genekspressionsanalyse er vist i figur 3B.
- Lav et regneark for at organisere placeringen af hver primer og prøve på 96-brønds qPCR-pladen.
- Præparation
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I modsætning til iBAT, som er placeret i det subkutane lag af ryggen mellem to skulderblade, er scBAT placeret i det mellemliggende lag af nakken og strækker sig dybt mellem lag af skeletmuskulatur og spytkirtlen, når den vokser langs den ydre halsvene (figur 1A). Dissekering af scBAT er ikke så ligetil som iBAT. Her giver vi en detaljeret procedure, herunder afgørende trin til dissekering af intakt scBAT fra postnatale og voksne mus (figur 1B, C). Efter åbning af halsen ved hjælp af den medfølgende protokol kan et tyndt lag scBAT identificeres under et dissekerende mikroskop og skrælles af fra den tilsluttede spytkirtel og ydre halsvene med et par tang (figur 1D, E). For at vurdere depotets morfologi blev frisk isoleret scBAT behandlet ved hjælp af den leverede behandlingsprocedure kombineret med en tidligere offentliggjort H&E-farvningsprocedure19 (figur 2A). Som vist i figur 2B har scBAT vævsstrukturer, der er typiske for BAT-depoter, og består af mange små, multilokulære adipocytter hos raske postnatale og voksne mus. For at vurdere genekspressionsniveauer i scBAT blev RNA ekstraheret fra isolerede scBAT-depoter ved hjælp af de leverede procedurer (figur 3A). Ekspressionsniveauer af gener af interesse kan derefter vurderes ved standard RT-qPCR-metoder (figur 3A). Som vist i figur 3B, de differentielle ekspressionsniveauer af gener, der er involveret i formidling af scBAT-funktion, herunder Pparg, masterregulatoren for BAT-udviklingen; Fabp4 og Glut4, to næringsstoftransportører; og Ucp1 og Ppargc1a, to gener involveret i termogenese, kan let bestemmes. Til sammenligning blev RNA ekstraheret fra isoleret iBAT, og ekspressionen af de ovennævnte gener blev også vurderet ved hjælp af de leverede procedurer (figur 3A). Ekspressionsniveauerne af disse gener er relativt ens mellem disse to depoter. (figur 3B).
Figur 1: Anatomisk placering af scBAT og processen med dens dissektion. A) scBAT's placering i det mellemliggende lag af halsen. (B) Det overfladiske lag af halsen før og efter huden er fjernet. Skalabjælke = 250 μm. Stiplede gule linjer skitserer det område, der skal udsættes efter at have lavet det U-formede snit. (C) Billede af en musekrop placeret under et dissekerende mikroskop for at øge visuel klarhed under dissektion. (D,E) Repræsentative billeder af det mellemliggende lag af halsen før og efter scBAT fjernes fra mus i alderen 3 uger og 3 måneder. Skalabjælke = 250 μm. Stiplede gule linjer skitserer eksponerede bilaterale scBAT-depoter; n = 2. Forkortelser: scBAT = supraklavikulært brunt fedtvæv; sfi = overfladisk lag; sg = spytkirtel; tr = luftrør; jv = ekstern jugular vene; SM = skeletmuskulatur. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Behandling af scBAT til H&E-farvning. (A) Rutediagram, der illustrerer de vigtigste trin i scBAT-behandling til H&E-farvning. Efter dissekering af vævet er det sekventielt fastgjort, dehydreret, indlejret, snittet og farvet. (B) Repræsentative billeder af H&E-farvet scBAT fra mus i alderen 3 uger og 3 måneder; n = 3 for hvert udviklingsstadium skalabjælke = 250 μm for billeder med lavere forstørrelse; skalabjælke = 50 μm for billeder med højere forstørrelse. Forkortelser: scBAT = supraklavikulært brunt fedtvæv; PFA = paraformaldehyd; H&E = hæmatoxylin og eosin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Fremstilling af RNA fra scBAT til genekspressionsanalyse. (A) Flowchart, der illustrerer stadierne af RNA-isolation og RT-qPCR-analyse af scBAT-genekspression. På grund af sin lille størrelse og bløde tekstur er snapfrysning af scBAT-depotet og formaling af det i flydende nitrogen afgørende for vellykket RNA-isolering. (B) Relativ ekspression af markørgener, herunder Pparg, Fabp4, Glut4, Ucp1 og Ppargc1a, i scBAT og iBAT isoleret fra hanmus i alderen 3 måneder, n = 5. Data præsenteres som gennemsnit ± SEM. 36B4 blev brugt som et husholdningsgen til normalisering. Forkortelser: scBAT = supraklavikulært brunt fedtvæv; RT-qPCR = revers transkription-kvantitativ PCR; LN2 = flydende nitrogen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol præsenterer vi detaljeret procedurerne for dissekering og behandling af scBAT til H&E- og genekspressionsanalyser. Fordi scBAT ligger i det mellemliggende lag af halsen og ligger langs de store vener, kræver isoleringen af dette depot præcis teknik. Specifikt for at få et klart overblik over depotet anbefaler vi at placere musen under et dissekerende mikroskop, efter at halsen er åbnet. Brug af et par superfine punktpincet til at skrælle scBAT af spytkirtlen og de omkringliggende vener, og sørg for at undgå punktering af venerne. Overdreven blødning kan gøre det vanskeligere at lokalisere scBAT. For at behandle scBAT til H&E-farvning tilpassede vi brugen af en offentliggjort protokol19 med små ændringer til at omfatte brugen af 4% PFA, dehydrerende alkoholer og et organisk opløsningsmiddel, toluen, til vævsbehandling som vist i protokolafsnittet. Hele proceduren tager ~ 6 dage at fuldføre, og H &E-farvede dias kan afbildes den næste dag efter afslutningen af farvningen.
RT-qPCR med RNA som udgangsmateriale er den hyppigst anvendte metode til genekspressionsanalyse inden for fedtvævsbiologi. Fordi scBAT er et relativt lille BAT-depot sammenlignet med iBAT, kan det være vanskeligt at opnå tilstrækkeligt RNA til genekspression. For at øge RNA-udbyttet anbefaler vi at anvende sekventielle lysatforberedelsestrin som beskrevet i protokolafsnittet, startende med at pulverisere vævet ved hjælp af en støder og mørtel, mens det er frosset. Ved hjælp af denne lysatpræparationsmetode har vi med succes opnået en RNA-prøve af høj kvalitet med højt udbytte til genekspressionsanalyse af scBAT fra en voksen mus. Denne lysatpræparationsmetode kan også anvendes til at opnå proteinlysater af høj kvalitet fra scBAT til western blotting ved anvendelse af proteinlysebuffer.
Ved hjælp af mus iBAT har forskere opnået betydelig viden om BAT-funktion i termogenese og metabolisme. Den nylige identifikation af nogle få tidligere ukendte BAT-depoter hos mus og mennesker, herunder scBAT, afslørede behovet for flere undersøgelser, før vi fuldt ud kan forstå det fysiologiske bidrag fra BAT hos mus og voksne mennesker. Især er undersøgelser, der belyser oprindelsen, funktionerne og involveringen af disse nyfundne BAT-depoter i termogenese og regional eller helkropsmetabolisme, berettigede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde understøttes af NIDDK fra NIH under tildelingsnummer R01DK116899, USDA / ARS under tildelingsnummer 3092-51000-064-000D og en pilotpris fra Baylor College of Medicine Cardiovascular Research Institute. Flowcharts blev produceret ved hjælp af BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 95% Dehydrant Alcohol (Flex 95) | Epredia | 8201 | |
| 100% Dehydrant Alcohol (Flex 100) | Epredia | 8101 | |
| 96-well PCR plate | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Aurum Binding Mini Column | Bio-Rad | 7326826 | |
| Aurum High Stringency Wash | Bio-Rad | 7326803 | |
| Aurum Low Stringency Wash | Bio-Rad | 7326804 | |
| Base Molds (for embedding) | Tissue-Tek | 4122 | |
| BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2" | Becton Dickinson | 305167 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1840148 | |
| Capless Microcentrifuge Tubes 2 mL | Fisherbrand | 02-681-453 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument | Bio-Rad | 12011319 | |
| Chloroform | Thermo Scientific Chemicals | 383760010 | |
| Cytoseal 60 Low-viscosity mounting medium | Epredia | 83104 | |
| DEPC-Treated Water | Ambion | AM 9906 | |
| Dissecting Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| DNase Dilution Solution | Bio-Rad | 7326805 | |
| DNase I | Bio-Rad | 7326828 | |
| dNTPs | Invitrogen | 18427013 | |
| Elution solution | Bio-Rad | 7326801 | |
| EM 400 embedding medium paraffin | Leica Biosystems | 3801320 | |
| Eosin Y (0.5% w/v) | RICCA | 2858-16 | |
| Formula R Infiltration medium paraffin | Leica Biosystems | 3801470 | |
| Genemark Nutator Gyromixer 349 | Bio Express | S-3200-2 | |
| Gill #3 Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS332-1L | |
| HCl (for HCL-Ethanol) | Fisher Chemical | A142212 | |
| IP VI Embedding Cassettes | Leica Biosystems | 39LC-550-5-L | |
| Koptec's Pure Ethanol - 200 Proof (for 70% Ethanol) | Decon Labs | V1001 | |
| MgCl2 (25 mM) | Thermo Fisher Scientific | R0971 | |
| Microcentrifuge Tubes 1.7 mL | Avantor | 87003-294 | |
| Microseal 'B' Seals (adhseive seals) | Bio-Rad | MSB1001 | |
| Microtome | Leica Biosystems | RM2245 | |
| Molecular Biology Grade Water | Corning | 46-000-CM | |
| Mortar Coors Tek | Thomas Scientific | 60310 | |
| NaCl (for 0.85% saline) | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop Technologies | ND-1000 UV/Vis | |
| Oligo dT | Invitrogen | 18418020 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Boekel Scientific | 14792V | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | |
| PCR Tube Strip | Avantor | 76318-802 | |
| Pestle by Coors Tek | Thomas Scientific | 60311 | |
| Pestle Pellet Motor | Kimble | 749540-0000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Precision Model 19 Vacuum Oven | Thermo Fisher Scientific | CAT# 51221162 | |
| Primer: 36B4 (forward) 10 μM 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: 36B4 (reverse) 10 μM 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Fabp4 (forward) 10 μM 5’ ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Fabp4 (reverse) 10 μM 5’ CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Glut 4 (forward primer) 10 μM 5’ CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Glut 4 (reverse) 10 μM 5’ GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: PPARg (forward) 10 μM 5’ AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: PPARg (reserve) 10 μM 5’ AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ppargc1a (reverse) 10 μM 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ppargc1a(forward) 10 μM 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ucp1 (forward) 10 μM 5’ AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ucp1 (reverse) 10 μM 5’ ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| RNA isolation solution (PureZol) | Bio-Rad | 7326880 | |
| RNase Away (surface decontaminant) | Thermo Scientific | 1437535 | |
| RNase H | NEB | M0297S | |
| Rnase inhibitor (RNase Out) | Invitrogen | 10777019 | |
| Scintillation Vial (glass) | Electron Microscopy Sciences | 72632 | |
| Slide drying bench | Electrothermal (Cole-Parmer) | MH6616 | |
| Stainless staining rack | Electron Microscopy Sciences | 70312-54 | |
| Stereo microscope (for embedding) | Olympus | SZ51 | |
| Sugical scissors | McKesson | 43-1-104 | |
| Superfine point Straight Dissecting Forceps | Avantor | 82027-402 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superscript III Reverse Transcriptase (Includes 5x First-Strand Buffer and 0.1M DTT) | Invitrogen | 18080044 | |
| SUR-VET syringe with needle 25 G x 5/8", 1 mL | Terumo | 100281 | |
| SYBR Green (qPCR enzyme master mixture) | Applied Biosystems | A25778 | |
| Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (jars) | Electron Microscopy Sciences | SKU: 62540-01 | |
| Toluene | Fisher Chemical | T324-1 | |
| Transfer pipette | Avantor | 414004-005 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL |
References
- Boutari, C., Mantzoros, C. S. A 2022 update on the epidemiology of obesity and a call to action: as its twin COVID-19 pandemic appears to be receding, the obesity and dysmetabolism pandemic continues to rage on. Metabolism. 133, 155217 (2022).
- Hales, C. M., Carroll, M. D., Fryar, C. D., Ogden, C. L. Prevalence of obesity and severe obesity among adults: United States, 2017-2018. NCHS Data Brief. (360), 1-8 (2020).
- Berry, D. C., Stenesen, D., Zeve, D., Graff, J. M. The developmental origins of adipose tissue. Development. 140 (19), 3939-3949 (2013).
- Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (11), 691-702 (2016).
- Maliszewska, K., Kretowski, A. Brown adipose tissue and its role in insulin and glucose homeostasis. Int J Mol Sci. 22 (4), 1530 (2021).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N Engl J Med. 360 (15), 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. N Engl J Med. 360 (15), 1500-1508 (2009).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. N Engl J Med. 360 (15), 1518-1525 (2009).
- Cypess, A. M., et al. Anatomical localization, gene expression profiling and functional characterization of adult human neck brown fat. Nat Med. 19 (5), 635-639 (2013).
- Leitner, B. P., et al. Mapping of human brown adipose tissue in lean and obese young men. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (32), 8649-8654 (2017).
- Mo, Q., et al. Identification and characterization of a supraclavicular brown adipose tissue in mice. JCI Insight. 2 (11), e93166 (2017).
- Shi, Y., et al. Gene Expression Analysis of Environmental Temperature and High-Fat Diet-Induced Changes in Mouse Supraclavicular Brown Adipose Tissue. Cells. 10 (6), 1370 (2021).
- Chang, L., et al. Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-gamma deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis. Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).
- Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cell Mol Life Sci. 76 (4), 777-789 (2019).
- de Jong, J. M., Larsson, O., Cannon, B., Nedergaard, J. A stringent validation of mouse adipose tissue identity markers. Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (12), E1085-E1105 (2015).
- Fu, M., et al. Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 39 (8), 1629-1644 (2019).
- Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning mammary gland whole mounts for lesion identification. J Vis Exp. (125), e55796 (2017).
- Berry, R., et al.
