Summary
여기에서는 쥐 쇄골 상부 갈색 지방 조직의 조직학적 및 유전자 발현 분석을 해부하고 수행하기 위한 실용적인 절차를 제공합니다.
Abstract
갈색 지방 조직(BAT)에 의한 열발생은 신진대사 조절에 중요한 역할을 하며, 그 형태와 기능은 생쥐와 인간의 환경 자극에 의해 크게 영향을 받을 수 있습니다. 현재 쥐의 상부 등쪽 측면에 있는 두 개의 견갑골 사이에 위치한 쥐 견갑간 BAT(iBAT)는 BAT 기능을 연구하기 위해 연구 실험실에서 사용하는 주요 BAT 저장소입니다. 최근에는 이전에 알려지지 않았던 몇 개의 BAT 저장소가 마우스에서 확인되었는데, 그 중 하나는 인간의 쇄골 상부 갈색 지방 조직과 유사합니다. iBAT와 달리 쥐 쇄골 상 갈색 지방 조직(scBAT)은 목의 중간층에 위치하므로 쉽게 접근할 수 없습니다.
새로 확인된 마우스 scBAT의 연구를 용이하게 하기 위해, 출생 후 및 성체 마우스로부터 온전한 scBAT를 해부하는 단계를 상세히 기술하는 프로토콜이 본 명세서에 제시되어 있다. scBAT는 다른 지방 저장소에 비해 크기가 작기 때문에 scBAT 처리를 위해 절차가 수정되고 최적화되었습니다. 이러한 수정 사항 중에는 조직 수집 중에 해부 현미경을 사용하여 냉동 scBAT 샘플의 정밀도와 균질화를 증가시켜 후속 qPCR 분석의 효율성을 높이는 것이 있습니다. 이러한 최적화를 통해 마우스에서 scBAT의 식별, 형태학적 외관 및 분자 특성을 결정할 수 있습니다.
Introduction
미국과 전 세계적으로 비만의 유병률이 증가함에 따라 비만의 원인을 이해하고 잠재적인 치료법을 식별하는 데 큰 관심이 높아지고 있습니다 1,2. 지방 조직은 신진대사에 중요한 역할을 하며, 지방 조직의 조절 장애는 비만의 발병으로 이어질 수 있습니다. 일반적으로 지방 조직에는 흰색과 갈색 지방 조직의 두 가지 유형이 있습니다. 백색 지방 조직(WAT)은 화학 에너지를 저장하고 내분비 인자를 분비할 수 있는 반면, 갈색 지방 조직(BAT)은 화학 에너지를 사용하여 열을 발생시키고 추위 속에서 체온을 유지할 수 있습니다 3,4. 이러한 독특한 능력으로 인해 BAT의 활성화는 에너지 소비를 증가시키고 인슐린 감수성을 향상시킬 수 있다5.
BAT는 비(非)떨림 열발생(uncoupling protein 1, UCP1)6에 의해 매개되는 과정을 통해 기능을 발휘합니다. 생쥐와 인간을 포함한 포유류는 다양한 양의 BAT를 가지고 있습니다. BAT의 고전적 견해는 이러한 지방 조직이 성인 인간보다 생쥐와 유아에게 더 풍부하다는 것입니다. 견갑골 사이의 상부 등쪽 측면에 위치한 iBAT는 생쥐에서 가장 많이 연구된 BAT 저장소입니다. 방사성 동위원소 이미징 및 생검 테스트를 적용하여 최근 연구에서는 성인의 여러 BAT 저장소를 확인했습니다. 깊은 목과 쇄골상 부위에서 발견되는 저장소를 포함한 이들 중 일부는 이전에 생쥐 또는 다른 모델 동물에서 확인되지 않았다 7,8,9,10,11. 이러한 BAT 저장소 중에서 scBAT는 성인에게 가장 자주 나타나는 저장소입니다. 인간에서 새로 발견된 이러한 BAT 저장소의 기원과 분자 기여도를 더 잘 이해하려면 유전자 및 분자 조작을 통해 이러한 저장소의 기능적 역할을 추적하고 테스트할 수 있는 생쥐의 동등한 저장소를 식별하는 것이 중요합니다. 따라서, 우리와 다른 연구자들은 scBAT12,13, 흉부 혈관 주위 BAT14,15, 신장 주위 BAT16 및 대동맥 주위 BAT17을 포함하여 마우스의 다른 해부학적 위치에서 이전에 알려지지 않은 몇 가지 BAT 저장소를 확인했습니다. 마우스 scBAT는 해부학적으로 인간의 scBAT와 유사하고 형태학적으로 고전적인 iBAT와 유사하여 높은 수준의 UCP112를 발현합니다.
쉽게 해부할 수 있는 마우스 iBAT와 달리 scBAT는 마우스 목의 중간층, 침샘 아래 및 외부 경정맥을 따라 위치합니다. 조직학적 및 분자 분석을 위해 이 저장소를 분리하는 것은 어려울 수 있습니다. 여기에서는 출생 후 및 성체 마우스에서 scBAT를 해부하고 조직학 및 유전자 발현 분석을 위해 이 저장소를 처리하는 절차를 자세히 설명합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
동물 시술은 베일러 의과대학(Baylor College of Medicine)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 모든 시술은 생후 3주 및 3개월 된 C57BL/6J 수컷 마우스에 대해 수행하였다. 해부에 앞서, 모든 쥐는 승인된 설치류 이산화탄소 안락사 절차를 사용하여 안락사시켰다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 시약 및 기기와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. scBAT 해부
- 쥐 사체를 작업대에 놓고 수술용 가위와 극세 포인트 집게를 70% 에탄올로 청소합니다.
- 쥐의 복부 목에 70% 에탄올을 뿌려 털을 적시고 털 오염을 최소화합니다.
- 쇄골을 따라 약 1.5cm의 양측 절개를 합니다.
- 이전 절개 끝에서 귀를 향해 세로로 약 1cm 길이로 자릅니다. 이렇게 하면 목 주위에 사각형 U자형 절개가 형성됩니다(그림 1A,B).
알림: scBAT는 목의 중간 층에 있습니다. 피부, 피하 지방 조직, 침샘으로 구성된 표층이 이 단계에서 노출됩니다. 중간층은 scBAT와 함께 경정맥과 목 근육을 포함합니다. 깊은 목 BAT와 동맥 및 경정맥을 포함하는 목의 깊은 층은 골격근을 제거함으로써 노출됩니다. - 마우스를 해부 현미경 아래에 놓고 노출된 목에 초점을 맞춥니다(그림 1C).
참고: 이 추가된 단계는 scBAT의 크기가 작기 때문에 필요한 조직 수집의 정밀도를 크게 높입니다. - 절개된 피부 부분을 집게로 들어 올려 침샘을 완전히 노출시킵니다.
- 수술용 가위와 집게를 사용하여 타액선과 쇄골 주변 조직 및 서로를 연결하는 조직을 분리합니다.
- 타액선을 들어 올려 scBAT 저장소를 노출시킵니다. BAT는 외부 경정맥을 따라 타액선의 아래쪽에 연결되어 있을 수 있습니다. 주변 조직과 대비되는 주황색으로 식별하십시오.
- 대상 지방 조직을 집게로 잡고 침샘에서 부드럽게 떼어냅니다.
- 타액선에서 분리되면 목 양쪽의 저장소가 완전히 제거될 때까지 외부 경정맥과 목 근육에서 scBAT를 계속 분리합니다.
- 절개된 각 scBAT 샘플을 해부 현미경(그림 1D,E)에서 검사하고 겸자를 사용하여 남아 있는 결합 조직을 제거합니다.
- 각 샘플을 10mL의 인산염 완충 식염수(PBS)가 들어 있는 유리 섬광 바이알에 넣고 현미경 아래에서 마우스를 꺼냅니다.
2. scBAT의 처리 및 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 ( 그림 2A 참조)
- PBS(단계 1.12)를 차가운 4% 파라포름알데히드(PFA) 10mL로 교체하고 바이알을 너트레이터에 놓고 밤새 4°C에서 흔들어 scBAT를 고정합니다.
알림: 관류 고정은 면역조직화학 분석을 위한 추가 처리가 필요한 경우 출생 후, 특히 성인 마우스에 적용할 수 있습니다. - 다음 날, 멸균 이송 피펫으로 바이알에서 PFA 용액을 제거하고 10-15mL의 PBS로 교체합니다. 바이알을 너트 위에 놓고 실온에서 30분 동안 흔들어 줍니다. PBS를 0.85% 식염수로 교체하고 실온에서 30분 더 계속 흔들어줍니다.
참고: 식염수는 DEPC 처리수(RNase 없음)에서 0.85% 식염수(NaCl) w/v입니다. PBS는 이 단계와 다음 단계에서 식염수를 대체할 수 있습니다. - 이송 피펫으로 0.85% 식염수를 제거하고 10mL의 70% 에탄올/0.85% 식염수를 바이알에 추가합니다. 바이알을 4°C 냉장고에서 밤새 또는 파라핀을 담을 준비가 될 때까지 보관합니다.
알림: PBS는 0.85% 식염수를 사용할 수 없는 경우 사용할 수 있습니다. scBAT는 더 쉬운 절편과 더 나은 보존 조직 형태를 위해 가능한 한 빨리 처리해야 합니다. - 파라핀을 포함하기 전에 일련의 에탄올 교환을 통해 scBAT를 탈수하여 조직에서 수분을 제거합니다.
- 시작하려면 이송 피펫으로 바이알에서 70% 에탄올/0.85% 식염수를 제거하고 10-15mL의 95% 탈수제 알코올을 추가하여 실온에서 너트레이터에서 바이알을 1시간 동안 흔듭니다. 이 단계를 한 번 반복합니다.
알림: 에탄올은 탈수제 알코올 용액 대신 사용할 수 있습니다. - 다음으로, 95% 탈수제 알코올을 10-15mL의 100% 탈수제 알코올로 교체하고 너트레이터에서 1시간 동안 계속 흔들어줍니다. 새로운 100% 탈수제 알코올을 리필하고 바이알의 scBAT 양에 따라 몇 시간 또는 밤새 계속 흔들어 줍니다.
- 시작하려면 이송 피펫으로 바이알에서 70% 에탄올/0.85% 식염수를 제거하고 10-15mL의 95% 탈수제 알코올을 추가하여 실온에서 너트레이터에서 바이알을 1시간 동안 흔듭니다. 이 단계를 한 번 반복합니다.
- 임베딩을 위해 scBAT를 제거하려면 바이알에 10mL의 톨루엔을 추가하고 scBAT가 투명해질 때까지 약 6-8시간 동안 너트레이터에서 계속 흔듭니다.
참고: 만족스러운 클리어링을 달성하는 데 필요한 시간은 scBAT의 크기에 따라 다릅니다. 오후에 침투 및 매립이 이루어질 수 있도록 아침에 즉시 청소를 시작하는 것이 좋습니다. - 파라핀 왁스에 scBAT를 삽입하려면 톨루엔을 제거하고 녹인 침투 파라핀 왁스 10mL를 바이알에 추가합니다. 바이알을 65°C의 오븐에 1시간 동안 넣습니다. 새 왁스로 이 단계를 반복합니다.
알림: 왁스가 완전히 액체가 되도록 매립을 시작하기 전에 밤새 오븐에서 왁스 펠릿을 녹이기 시작합니다. - 침투 파라핀 왁스를 임베디드 파라핀 왁스로 교체하고 바이알을 동일한 온도에서 1시간 동안 둡니다. 이 단계를 한 번 반복합니다.
알림: 침투 stage는 중단되고 나중에 계속될 수 있습니다. 오븐에서 바이알을 꺼내 계속할 준비가 될 때까지 실온에 보관합니다. - 먼저 조직을 조직 임베딩 몰드에 넣어 매립하고, 녹인 임베딩 왁스를 몰드에 추가하고, 실체현미경으로 조직의 방향을 변경합니다. 그런 다음 왁스 위에 임베딩 카세트를 놓고 왁스가 가득 차고 임베딩 캡이 왁스 블록에 고정될 때까지 그 위에 임베딩 왁스를 계속 붓습니다. 블록을 밤새 4°C 냉장고로 옮겨 왁스가 뻣뻣해지고 수축되도록 한 후 금형을 제거합니다.
- scBAT를 마이크로톰으로 5-6μm18 두께로 절단하고, 현미경 슬라이드당 3-4개의 섹션을 분할하고, 조직 절편이 매끄럽게 될 수 있도록 ~42°C의 따뜻한 파라핀 섹션 부양 수조에 넣습니다.
- 섹션을 슬라이드로 옮기고 슬라이드를 부양 수조에 똑바로 세워 슬라이드에서 물이 떨어질 수 있도록 합니다.
- 슬라이드를 스테인리스 염색 랙으로 옮기고 랙을 슬라이드 건조 벤치에 올려 놓고 밤새 건조시킵니다.
알림: 파라핀 슬라이드는 추가 처리가 이루어지기 전에 실온에서 장기간 보관할 수 있습니다. - H&E 염색수행 19. 시작하려면 슬라이드를 염색 선반에 넣은 다음 랙을 크실렌이 든 염색 용기에 40초 동안 놓습니다. 이 단계를 한 번 반복합니다.
알림: 두 단계 후에도 파라핀이 여전히 보이면 완전히 용해될 때까지 기다렸다가 계속하십시오. - 조직에 수분을 보충하려면 슬라이드 랙을 100% 탈수제 알코올로 채워진 염색 용기에 넣고 20초 동안 두 번 s를 둡니다.tage 15% 탈수제 알코올에 95초, ddH2O에서 마지막으로 15초 헹굽니다.
- 슬라이드를 헤마톡실린 용액으로 채워진 염색 접시에 75초 동안 넣어 핵 염색을 달성한 다음 ddH2O로 염색 접시에서 슬라이드를 45초 동안 헹굽니다.
알림: 원하는 얼룩 색상에 따라 시간을 조정할 수 있습니다. - HCl-에탄올 용액으로 채워진 염색 접시에 슬라이드를 15초 동안 담근 다음 슬라이드를 다른 ddH2O 헹굼으로 15초 동안 옮겨 염색을 구별합니다.
참고: HCl-에탄올 용액은 공표된 방법19에 따라 제조된다. - 세포질 염색의 경우 슬라이드를 Eosin Y 대조염색 용액에 15초 동안 넣습니다.
- 슬라이드를 3개의 연속적인 95% 탈수제 알코올 용액 단계에서 각각 15초 동안 담근 다음 두 개의 순차적 100% 탈수제 알코올 수조(첫 번째는 15초, 두 번째는 45초)를 담가 조직을 탈수하여 탈수를 완료합니다.
- 마지막으로 슬라이드를 크실렌 수조로 옮겨 45초 동안 조직을 유기 용매에 재적응시킵니다. 이 단계가 끝나면 염색이 완료됩니다. 용액에서 조직을 제거합니다.
- 각 슬라이드에 장착 매체를 적용하고 화학 흄 후드 내부에 커버슬립합니다. 이미징 전에 밤새 건조시킵니다. 이미징 결과는 그림 2B에 나와 있습니다.
3. scBAT의 유전자 발현 분석
- 조직 수집(분쇄)
- scBAT를 해부한 후 즉시 조직을 미세 원심분리기 튜브에 넣고 멸균 바늘로 튜브 상단에 구멍을 뚫고 액체 질소에 스냅 얼립니다.
참고: 여기에 설명된 프로토콜의 주요 단계는 그림 3A에 설명되어 있습니다. 액체 질소에 떨어뜨리기 전에 튜브 상단에 구멍을 뚫으면 급격한 압력 변화로 인해 튜브가 파열되는 것을 방지할 수 있습니다. - 플라스틱 비커에 액체 질소를 채우고 유봉과 얇은 주걱을 담그십시오.
알림: 모든 도구 및 조직의 온도를 유지하는 것이 중요합니다.amp조직이 해동되는 것을 방지하기 위해 전체 절차 동안 액체 질소의 온도에 가깝게 가능한 한 차갑게 유지합니다. 해동된 지방 조직은 매우 부착성이 뛰어나 분말을 더 어렵게 만듭니다. 도구와 s만 제거하십시오.amp사용하기 직전에 액체 질소 수조에서. - 한 번에 하나의 스냅 냉동 조직 샘플을 가져와 마이크로 원심분리기 튜브에서 모르타르에 붓습니다.
- 모르타르에 소량의 액체 질소를 넣은 다음 유봉을 사용하여 냉동 조직이 완전히 분쇄될 때까지 갈아줍니다.
알림: 조직이 어느 지점에서든 부드러워지거나 끈적거리기 시작하면 해동되고 있는 것입니다. 모르타르에 더 많은 액체 질소를 붓습니다. - 얇은 주걱을 사용하여 분쇄된 조직을 조심스럽게 긁어내어 미세 원심분리기 튜브로 다시 옮깁니다. 주걱으로 옮기기 전에 긁어내는 동안 액체 질소를 모르타르에 붓고 남은 조직 조각을 모으십시오. 모르타르에서 모든 조직이 제거될 때까지 이송 단계를 반복합니다.
- 다음 샘플을 버리기 전에 경량 티슈 와이퍼와 70% 에탄올로 모르타르를 청소하십시오.amp분쇄합니다. 분말 티슈는 -80°C 냉동실에 장기간 보관하십시오.
- scBAT를 해부한 후 즉시 조직을 미세 원심분리기 튜브에 넣고 멸균 바늘로 튜브 상단에 구멍을 뚫고 액체 질소에 스냅 얼립니다.
- 전체 RNA 분리
- 준비
- 작업대, 피펫, 팁 홀더 및 튜브 랙을 70% 에탄올과 표면 오염 제거제로 세척하여 RNase를 제거합니다.
- 원심분리기를 가동하여 4°C에 도달합니다.
- 용출액을 70°C로 데웁니다.
- 샘플당 5μL의 재구성된 DNase I과 75μL의 DNase 희석 용액을 혼합하여 DNase I을 희석합니다. DNase I 용액을 사용할 때까지 얼음 위에 놓습니다.
- 절차
- 각 샘플에 대해 마이크로 원심분리기 튜브 2개, 컬럼 고정 튜브 2개(뚜껑이 없는 눈금이 매겨진 마이크로 원심분리기 튜브 2개) 및 바인딩 미니 컬럼 1개에 라벨을 붙입니다.
- 각 샘플에 500μL의 RNA 분리 용액을 추가하고 펠릿 유봉 모터를 사용하여 30초 동안 초음파 처리합니다.
- 각 샘플에 대해 주사기를 가져와 조직을 추가로 용해하기 위해 위아래로 10회 피펫합니다. 주사기 후 고형물이 보이지 않는지 확인하십시오.
- 250μL의 클로로포름과 와류를 가끔 첨가하고 샘플이 실온에서 배양될 때까지 5분 동안 기다립니다.
- 21,000 × g 에서 4 °C에서 20 분 동안 원심 분리.
- 상단 수성 부분을 새 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮기고 동등한 양의 70 % 에탄올 (~ 500 μL)을 첨가합니다.
참고: 상단 수성 부분은 투명해야 하고 하단은 빨간색 RNA 분리 용액이어야 하며 두 층 사이에는 원치 않는 고체가 있어야 합니다. - 500μL의 새 용해물을 결합 컬럼으로 옮깁니다. 18,000× g 에서 60초 동안 원심분리한 다음 여과액을 버립니다.
- 나머지 용해물로 이전 단계를 반복하여 모든 RNA를 결합 컬럼으로 가져옵니다.
- 700μL의 저강도 세척액을 바인딩 컬럼에 추가하고 30초 동안 원심분리한 후 여과액을 버립니다.
- 80μL의 희석된 DNase I을 각 결합 컬럼에 추가합니다. 실온에서 15분간 배양합니다.
- 700μL의 고강도 세척을 추가하고 30초 동안 원심분리한 후 여과액을 버립니다.
- 700μL의 낮은 엄격성 세척을 추가하고 60초 동안 원심분리한 다음 여과액을 버립니다.
- 바인딩 컬럼을 2번째 새 뚜껑이 없는 컬럼 고정 튜브로 옮기고 2분 동안 원심분리하여 바인딩 컬럼에서 모든 액체가 제거되도록 합니다.
- 결합 컬럼을 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 30μL의 따뜻한 용출 용액을 추가합니다. 실온에서 1분 동안 배양합니다.
- 마이크로 원심분리기 튜브 바닥에서 용출된 RNA를 수집하기 위해 2분 동안 원심분리합니다.
- 분광 광도계를 사용하여 총 RNA 농도를 측정합니다.
참고: 총 RNA 순도가 낮고 260/280 값이 2.0 미만이거나 260/230 값이 1.8 미만으로 표시되는 경우 3.2.2.12단계 후에 샘플을 낮은 엄격성 세척으로 한 번 더 세척한 다음 3.2.2.13 단계를 계속하기 전에 80% 에탄올로 세척할 수 있습니다. - RNA를 -80°C 냉동고에 보관합니다.
- 역전사(RT)
- PCR 튜브 스트립에서 DEPC 처리수에 희석된 총 RNA 0.5-1μg을 각 RNA 샘플에 대해 총 8μL를 다른 웰에 추가합니다.
참고: 역전사에 사용되는 RNA의 양은 제조업체의 지침에 따라 확대 또는 축소할 수 있습니다. - PCR 튜브의 각 샘플에 1μL Oligo dT 및 1μL의 dNTP를 추가합니다. 총 부피가 샘플당 10μL인지 확인합니다.
- PCR 튜브 스트립을 thermocycler에 넣고 65°C에서 5분 동안 설정한 다음 4°C로 무한정 설정합니다.
- 65°C에서 5분 후 PCR 튜브 스트립을 꺼내 튜브를 얼음 위에 최소 2분 동안 놓습니다. 얼음에서 배양한 후 5x First-Strand 완충액 4μL, 25mM MgCl2 2μL, 0.1M DTT 2μL, RNase 억제제 1μL, 역전사 효소 1μL의 5개 시약을 각 샘플에 추가합니다. 이제 총 부피가 샘플당 20μL인지 확인합니다.
- PCR 튜브 스트립을 열순환기에 다시 넣고 프로그램을 50분 동안 50°C로 설정한 다음 85°C에서 5분 동안 설정한 다음 4°C로 무한정 설정합니다.
- 프로그램이 4°C에 도달하면 스트립을 꺼내고 1μL의 리보뉴클레아제 H(RNase H)를 추가합니다.
참고: RNase H는 RT 반응에서 남아 있는 RNA 템플릿을 제거하는 데 사용됩니다. 이 단계에서 원하는 RNA는 이미 cDNA로 변환되어야 합니다. - 스트립을 열전 순환기에 다시 넣고 37°C에서 20분 동안 작동한 다음 4°C를 무기한 동안 실행합니다.
- 역전사가 완료되었습니다. 분광 광도계를 사용하여 cDNA 농도를 측정합니다.
- cDNA를 250ng/μL로 희석합니다. cDNA를 -80 °C 또는 -20 °C 냉동고에 보관합니다.
- PCR 튜브 스트립에서 DEPC 처리수에 희석된 총 RNA 0.5-1μg을 각 RNA 샘플에 대해 총 8μL를 다른 웰에 추가합니다.
- 정량 PCR(qPCR)
- 스프레드시트를 만들어 96웰 qPCR 플레이트에서 모든 프라이머와 샘플의 위치를 정리할 수 있습니다.
참고: 프라이머 중 하나는 36B4와 같은 다른 모든 관심 유전자의 발현을 정상화하기 위한 참조 유전자여야 합니다. - 각 "프라이머 + 샘플" 조합에 대한 프라이머 마스터 믹스를 만듭니다. 각 qPCR 반응 웰에 분자생물학 등급 물 3μL, qPCR 효소 마스터 혼합물 5μL, 순방향 프라이머 0.5μL, 역방향 프라이머 0.5μL를 추가하여 반응당 최대 9μL를 추가합니다. 반응당 1μL의 cDNA를 추가하여 반응당 총 10μL의 웰을 만듭니다.
참고: 표준은 각 "프라이머 + 샘플" 조합에 대해 3개의 기술 반복을 갖는 것이므로 각 마스터 믹스는 위 수량의 4배여야 합니다. - 각 복제물에 대해 1μL의 cDNA를 각 프라이머 마스터 믹스에 추가합니다. 각 마스터 혼합물이 4x인 경우 각 샘플 cDNA 4μL를 자체 표지된 튜브에 피펫합니다.
- 마지막으로, 각 반응 혼합물 10μL를 스프레드시트에 의해 결정된 위치의 96웰 qPCR 플레이트에 피펫합니다.
- 두꺼운 접착 씰로 플레이트를 밀봉한 다음 96웰 플레이트를 20°C에서 450× g 에서 2분 동안 원심분리합니다.
알림: 샘플을 방지하기 위해 플레이트를 완전히 밀봉하는 것이 중요합니다.amp열순환 중에 증발합니다. 경량 티슈 와이퍼를 사용하여 씰을 플레이트, 특히 가장자리에 아래로 누릅니다. - Real-Time PCR 기기에서 플레이트를 실행합니다. 제조업체의 지침에 따라 PCR 반응을 프로그래밍합니다: 50°C에서 2분, 95°C에서 2분, 마지막으로 95°C에서 15초, 60°C에서 30초씩 40회 주기. qPCR 유전자 발현 분석 결과는 그림 3B에 나와 있습니다.
- 스프레드시트를 만들어 96웰 qPCR 플레이트에서 모든 프라이머와 샘플의 위치를 정리할 수 있습니다.
- 준비
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
두 견갑골 사이의 등 피하층에 위치한 iBAT와 달리 scBAT는 목의 중간층에 위치하며 외경정맥을 따라 성장하면서 골격근과 타액선 층 사이 깊숙이 뻗어 있습니다(그림 1A). scBAT를 분석하는 것은 iBAT만큼 간단하지 않습니다. 여기에서는 출생 후 및 성체 마우스에서 온전한 scBAT를 해부하기 위한 중요한 단계를 포함한 자세한 절차를 제공합니다(그림 1B,C). 제공된 프로토콜을 사용하여 목을 연 후 해부 현미경으로 scBAT의 얇은 층을 식별하고 한 쌍의 겸자를 사용하여 연결된 타액선과 외부 경정맥에서 벗겨낼 수 있습니다(그림 1D,E). 저장소의 형태를 평가하기 위해, 새로 분리된 scBAT를 이전에 공개된 H&E 염색 절차(19)와 결합된 제공된 처리 절차를 사용하여 처리하였다(그림 2A). 그림 2B에서 볼 수 있듯이 scBAT는 BAT 저장소의 전형적인 조직 구조를 가지고 있으며 건강한 출생 후 및 성체 마우스에서 많은 작은 다기관 지방 세포로 구성됩니다. scBAT에서 유전자 발현 수준을 평가하기 위해 제공된 절차를 사용하여 분리된 scBAT 저장소에서 RNA를 추출했습니다(그림 3A). 그런 다음 표준 RT-qPCR 방법으로 관심 유전자의 발현 수준을 평가할 수 있습니다(그림 3A). 도 3B에서 볼 수 있듯이, BAT 발달의 마스터 조절자인 Pparg를 포함하여 scBAT 기능을 매개하는 데 관여하는 유전자의 차등 발현 수준; Fabp4 및 Glut4, 두 개의 영양 수송체; 그리고 Ucp1 및 Ppargc1a, 열 발생에 관여하는 두 개의 유전자를 쉽게 결정할 수 있습니다. 비교를 위해, RNA는 분리된 iBAT로부터 추출되었고, 위에 열거된 유전자의 발현도 제공된 절차를 사용하여 평가되었다(도 3A). 이 유전자의 발현 수준은 이 두 저장소 간에 비교적 유사합니다. (그림 3B).
그림 1: scBAT의 해부학적 위치 및 해부 과정. (A) 목의 중간층에서 scBAT의 위치. (B) 피부를 제거하기 전과 후의 목의 표층. 눈금 막대 = 250μm. 노란색 점선은 U자형 절개 후 노출되어야 하는 부위의 윤곽선입니다. (C) 해부 중 시각적 선명도를 높이기 위해 해부 현미경 아래에 놓인 쥐 사체의 이미지. (디,이) scBAT를 3주 및 3개월 된 마우스에서 제거한 scBAT 전과 후의 목 중간층의 대표 이미지. 눈금 막대 = 250μm. 노란색 점선은 노출된 양측 scBAT 저장소의 윤곽을 그립니다. n = 2입니다. 약어: scBAT = 쇄골상 갈색 지방 조직; SFI = 표층; sg = 타액선; tr = 기관; jv = 외부 경정맥; sm = 골격근. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: H&E 염색을 위한 scBAT 처리. (A) H&E 염색을 위한 scBAT 처리의 주요 단계를 보여주는 흐름도. 조직을 해부한 후 순차적으로 고정, 탈수, 매립, 절편 및 염색을 거칩니다. (B) 3주 및 3개월 된 마우스의 H&E 염색 scBAT의 대표 이미지; 각 발달 단계에 대해 n = 3; 스케일 바 = 250 μm(저배율 이미지용); 스케일 바 = 50μm(고배율 이미지용). 약어: scBAT = 쇄골상 갈색 지방 조직; PFA = 파라포름알데히드; H&E = 헤마톡실린 및 에오신. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 유전자 발현 분석을 위한 scBAT의 RNA 준비. (A) scBAT 유전자 발현의 RNA 분리 및 RT-qPCR 분석 단계를 보여주는 흐름도. 크기가 작고 질감이 부드럽기 때문에 scBAT 저장소를 스냅 냉동하고 액체 질소로 분쇄하는 것이 성공적인 RNA 분리에 매우 중요합니다. (B) 생후 3개월 된 수컷 마우스에서 분리한 scBAT 및 iBAT에서 Pparg, Fabp4, Glut4, Ucp1 및 Ppargc1a를 포함하는 마커 유전자의 상대적 발현, n=5. 데이터는 평균으로 제시됩니다 ± SEM. 36B4 는 정규화를 위한 하우스키핑 유전자로 사용되었습니다. 약어: scBAT = 쇄골상 갈색 지방 조직; RT-qPCR = 역전사-정량적 PCR; LN2 = 액체 질소. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 프로토콜에서는 H&E 및 유전자 발현 분석을 위한 scBAT의 해부 및 처리 절차를 자세히 설명합니다. scBAT는 목의 중간층에 있고 큰 정맥을 따라 놓여 있기 때문에 이 저장소의 격리에는 정밀한 기술이 필요합니다. 특히, 창고를 명확하게 보려면 목을 연 후 해부 현미경 아래에 마우스를 놓는 것이 좋습니다. 한 쌍의 초미세 포인트 겸자를 사용하여 타액선과 주변 정맥에서 scBAT를 벗겨내고 정맥에 구멍이 뚫리지 않도록 주의해야 합니다. 출혈이 과도하면 scBAT를 찾기가 더 어려워질 수 있습니다. H&E 염색을 위한 scBAT를 처리하기 위해, 프로토콜 섹션에 표시된 바와 같이 조직 처리를 위해 4% PFA, 탈수제 알코올 및 유기 용매인 톨루엔을 사용하기 위해 약간의 수정을 가하여 공개된 프로토콜19 의 사용을 조정했습니다. 전체 절차를 완료하는 데 ~6일이 소요되며 H&E 염색 슬라이드는 염색 완료 후 다음날 이미지화할 수 있습니다.
RNA를 출발물질로 사용하는 RT-qPCR은 지방조직 생물학 분야에서 유전자 발현 분석에 가장 많이 사용되는 방법입니다. scBAT는 iBAT에 비해 상대적으로 작은 BAT 저장소이기 때문에 유전자 발현을 위한 충분한 RNA를 얻는 것이 어려울 수 있습니다. RNA 수율을 높이려면 프로토콜 섹션에 설명된 대로 냉동 상태에서 유봉과 모르타르를 사용하여 조직을 분말화하는 것으로 시작하여 순차적 용해물 준비 단계를 적용하는 것이 좋습니다. 이 용해물 전처리 방법을 사용하여 성체 마우스 한 마리에서 scBAT의 유전자 발현 분석을 위한 고수율 고품질 RNA 샘플을 성공적으로 획득했습니다. 이 용해물 전처리 방법은 단백질 용해 완충액을 사용하여 웨스턴 블로팅을 위해 scBAT로부터 고품질 단백질 용해물을 얻는 데에도 적용할 수 있습니다.
연구진은 마우스 iBAT를 사용하여 열 발생 및 신진대사에서 BAT 기능에 대한 상당한 지식을 얻었습니다. scBAT를 포함하여 생쥐와 인간에서 이전에 알려지지 않았던 몇 가지 BAT 저장소가 최근 확인됨에 따라 생쥐와 성체에서 BAT의 생리학적 기여를 완전히 이해하기 전에 더 많은 연구가 필요하다는 사실이 밝혀졌습니다. 특히, 새로 발견된 BAT 저장소의 기원, 기능 및 열 발생 및 국소 또는 전신 대사에 대한 관여를 밝히는 연구가 필요합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 NIH의 NIDDK의 Award Number R01DK116899, USDA/ARS의 Award Number 3092-51000-064-000D, Baylor College of Medicine Cardiovascular Research Institute의 파일럿 어워드의 지원을 받습니다. 순서도는 BioRender를 사용하여 제작되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 95% Dehydrant Alcohol (Flex 95) | Epredia | 8201 | |
| 100% Dehydrant Alcohol (Flex 100) | Epredia | 8101 | |
| 96-well PCR plate | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Aurum Binding Mini Column | Bio-Rad | 7326826 | |
| Aurum High Stringency Wash | Bio-Rad | 7326803 | |
| Aurum Low Stringency Wash | Bio-Rad | 7326804 | |
| Base Molds (for embedding) | Tissue-Tek | 4122 | |
| BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2" | Becton Dickinson | 305167 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1840148 | |
| Capless Microcentrifuge Tubes 2 mL | Fisherbrand | 02-681-453 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument | Bio-Rad | 12011319 | |
| Chloroform | Thermo Scientific Chemicals | 383760010 | |
| Cytoseal 60 Low-viscosity mounting medium | Epredia | 83104 | |
| DEPC-Treated Water | Ambion | AM 9906 | |
| Dissecting Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| DNase Dilution Solution | Bio-Rad | 7326805 | |
| DNase I | Bio-Rad | 7326828 | |
| dNTPs | Invitrogen | 18427013 | |
| Elution solution | Bio-Rad | 7326801 | |
| EM 400 embedding medium paraffin | Leica Biosystems | 3801320 | |
| Eosin Y (0.5% w/v) | RICCA | 2858-16 | |
| Formula R Infiltration medium paraffin | Leica Biosystems | 3801470 | |
| Genemark Nutator Gyromixer 349 | Bio Express | S-3200-2 | |
| Gill #3 Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS332-1L | |
| HCl (for HCL-Ethanol) | Fisher Chemical | A142212 | |
| IP VI Embedding Cassettes | Leica Biosystems | 39LC-550-5-L | |
| Koptec's Pure Ethanol - 200 Proof (for 70% Ethanol) | Decon Labs | V1001 | |
| MgCl2 (25 mM) | Thermo Fisher Scientific | R0971 | |
| Microcentrifuge Tubes 1.7 mL | Avantor | 87003-294 | |
| Microseal 'B' Seals (adhseive seals) | Bio-Rad | MSB1001 | |
| Microtome | Leica Biosystems | RM2245 | |
| Molecular Biology Grade Water | Corning | 46-000-CM | |
| Mortar Coors Tek | Thomas Scientific | 60310 | |
| NaCl (for 0.85% saline) | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop Technologies | ND-1000 UV/Vis | |
| Oligo dT | Invitrogen | 18418020 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Boekel Scientific | 14792V | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | |
| PCR Tube Strip | Avantor | 76318-802 | |
| Pestle by Coors Tek | Thomas Scientific | 60311 | |
| Pestle Pellet Motor | Kimble | 749540-0000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Precision Model 19 Vacuum Oven | Thermo Fisher Scientific | CAT# 51221162 | |
| Primer: 36B4 (forward) 10 μM 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: 36B4 (reverse) 10 μM 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Fabp4 (forward) 10 μM 5’ ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Fabp4 (reverse) 10 μM 5’ CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Glut 4 (forward primer) 10 μM 5’ CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Glut 4 (reverse) 10 μM 5’ GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: PPARg (forward) 10 μM 5’ AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: PPARg (reserve) 10 μM 5’ AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ppargc1a (reverse) 10 μM 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ppargc1a(forward) 10 μM 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ucp1 (forward) 10 μM 5’ AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ucp1 (reverse) 10 μM 5’ ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| RNA isolation solution (PureZol) | Bio-Rad | 7326880 | |
| RNase Away (surface decontaminant) | Thermo Scientific | 1437535 | |
| RNase H | NEB | M0297S | |
| Rnase inhibitor (RNase Out) | Invitrogen | 10777019 | |
| Scintillation Vial (glass) | Electron Microscopy Sciences | 72632 | |
| Slide drying bench | Electrothermal (Cole-Parmer) | MH6616 | |
| Stainless staining rack | Electron Microscopy Sciences | 70312-54 | |
| Stereo microscope (for embedding) | Olympus | SZ51 | |
| Sugical scissors | McKesson | 43-1-104 | |
| Superfine point Straight Dissecting Forceps | Avantor | 82027-402 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superscript III Reverse Transcriptase (Includes 5x First-Strand Buffer and 0.1M DTT) | Invitrogen | 18080044 | |
| SUR-VET syringe with needle 25 G x 5/8", 1 mL | Terumo | 100281 | |
| SYBR Green (qPCR enzyme master mixture) | Applied Biosystems | A25778 | |
| Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (jars) | Electron Microscopy Sciences | SKU: 62540-01 | |
| Toluene | Fisher Chemical | T324-1 | |
| Transfer pipette | Avantor | 414004-005 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL |
References
- Boutari, C., Mantzoros, C. S. A 2022 update on the epidemiology of obesity and a call to action: as its twin COVID-19 pandemic appears to be receding, the obesity and dysmetabolism pandemic continues to rage on. Metabolism. 133, 155217 (2022).
- Hales, C. M., Carroll, M. D., Fryar, C. D., Ogden, C. L. Prevalence of obesity and severe obesity among adults: United States, 2017-2018. NCHS Data Brief. (360), 1-8 (2020).
- Berry, D. C., Stenesen, D., Zeve, D., Graff, J. M. The developmental origins of adipose tissue. Development. 140 (19), 3939-3949 (2013).
- Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (11), 691-702 (2016).
- Maliszewska, K., Kretowski, A. Brown adipose tissue and its role in insulin and glucose homeostasis. Int J Mol Sci. 22 (4), 1530 (2021).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N Engl J Med. 360 (15), 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. N Engl J Med. 360 (15), 1500-1508 (2009).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. N Engl J Med. 360 (15), 1518-1525 (2009).
- Cypess, A. M., et al. Anatomical localization, gene expression profiling and functional characterization of adult human neck brown fat. Nat Med. 19 (5), 635-639 (2013).
- Leitner, B. P., et al. Mapping of human brown adipose tissue in lean and obese young men. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (32), 8649-8654 (2017).
- Mo, Q., et al. Identification and characterization of a supraclavicular brown adipose tissue in mice. JCI Insight. 2 (11), e93166 (2017).
- Shi, Y., et al. Gene Expression Analysis of Environmental Temperature and High-Fat Diet-Induced Changes in Mouse Supraclavicular Brown Adipose Tissue. Cells. 10 (6), 1370 (2021).
- Chang, L., et al. Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-gamma deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis. Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).
- Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cell Mol Life Sci. 76 (4), 777-789 (2019).
- de Jong, J. M., Larsson, O., Cannon, B., Nedergaard, J. A stringent validation of mouse adipose tissue identity markers. Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (12), E1085-E1105 (2015).
- Fu, M., et al. Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 39 (8), 1629-1644 (2019).
- Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning mammary gland whole mounts for lesion identification. J Vis Exp. (125), e55796 (2017).
- Berry, R., et al.
