In questo articolo, forniamo una procedura pratica per la dissezione e l'esecuzione di analisi istologiche e di espressione genica del tessuto adiposo bruno sopraclavicolare murino.
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Articolo metodologico
Dissezione, elaborazione istologica e analisi dell'espressione genica del tessuto adiposo bruno sopraclavicolare murino
In questo articolo
Sommario
Abstract
La termogenesi mediata dal tessuto adiposo bruno (BAT) svolge un ruolo importante nella regolazione del metabolismo e la sua morfologia e funzione possono essere notevolmente influenzate dagli stimoli ambientali nei topi e nell'uomo. Attualmente, il BAT interscapolare murino (iBAT), che si trova tra due scapole nel fianco dorsale superiore dei topi, è il principale deposito di BAT utilizzato dai laboratori di ricerca per studiare la funzione dei BAT. Recentemente, sono stati identificati alcuni depositi BAT precedentemente sconosciuti nei topi, tra cui uno analogo al tessuto adiposo bruno sopraclavicolare umano. A differenza dell'iBAT, il tessuto adiposo bruno sopraclavicolare murino (scBAT) si trova nello strato intermedio del collo e quindi non è facilmente accessibile.
Per facilitare lo studio di scBAT murini appena identificati, viene presentato un protocollo che descrive in dettaglio i passaggi per sezionare scBAT intatti da topi postnatali e adulti. A causa delle piccole dimensioni di scBAT rispetto ad altri depositi adiposi, le procedure sono state modificate e ottimizzate specificamente per il trattamento di scBAT. Tra queste modifiche c'è l'uso di un microscopio da dissezione durante la raccolta dei tessuti per aumentare la precisione e l'omogeneizzazione dei campioni scBAT congelati per aumentare l'efficienza della successiva analisi qPCR. Con queste ottimizzazioni, è possibile determinare l'identificazione, l'aspetto morfologico e la caratterizzazione molecolare dello scBAT nei topi.
Introduzione
La crescente prevalenza dell'obesità negli Stati Uniti e in tutto il mondo ha suscitato un grande interesse per la comprensione della sua eziologia e l'identificazione di potenziali trattamenti 1,2. Il tessuto adiposo svolge un ruolo fondamentale nel metabolismo e la disregolazione del tessuto adiposo può portare allo sviluppo dell'obesità. Generalmente, esistono due tipi di tessuto adiposo, il tessuto adiposo bianco e il tessuto adiposo bruno. Mentre il tessuto adiposo bianco (WAT) può immagazzinare energia chimica e secernere fattori endocrini, il tessuto adiposo bruno (BAT) può utilizzare l'energia chimica ....
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Protocollo
Le procedure sugli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee presso il Baylor College of Medicine. Tutte le procedure sono state eseguite su topi maschi C57BL/6J di età compresa tra 3 settimane e 3 mesi. Prima della dissezione, tutti i topi sono stati sottoposti a eutanasia utilizzando la procedura approvata per l'eutanasia dell'anidride carbonica dei roditori. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti e gli strumenti utilizzati in questo protocollo.
1. Dissezione di scBAT
- Posiziona la carcassa del topo sul banco da lavoro e pulisci ....
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Risultati
A differenza dell'iBAT, che si trova nello strato sottocutaneo della schiena tra due scapole, lo scBAT è situato nello strato intermedio del collo, che si estende in profondità tra gli strati del muscolo scheletrico e della ghiandola salivare mentre cresce lungo la vena giugulare esterna (Figura 1A). L'analisi di scBAT non è così semplice come iBAT. Qui, forniamo una procedura dettagliata che include passaggi cruciali per la dissezione di scBAT intatti da top.......
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Discussione
In questo protocollo, presentiamo in dettaglio le procedure per la dissezione e l'elaborazione di scBAT per l'analisi di H&E e di espressione genica. Poiché lo scBAT risiede nello strato intermedio del collo e si trova lungo le grandi vene, l'isolamento di questo deposito richiede una tecnica precisa. In particolare, per ottenere una visione chiara del deposito, si consiglia di posizionare il topo sotto un microscopio da dissezione dopo l'apertura del collo. Utilizzando un paio di pinze a punta superfine per staccare lo .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è supportato dal NIDDK del NIH con il numero di premio R01DK116899, dall'USDA/ARS con il numero di premio 3092-51000-064-000D e da un premio pilota del Baylor College of Medicine Cardiovascular Research Institute. I diagrammi di flusso sono stati prodotti utilizzando BioRender.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Alcool disidratante al 95% (Flex 95) | Epredia | 8201 | |
| Alcool disidratante al 100% (Flex 100) | Epredia | 8101 | |
| Piastra PCR a 96 pozzetti | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Aurum Binding Mini colonna | Bio-Rad | 7326826 | |
| Aurum High Stringency Wash | Bio-Rad | 7326803 | |
| Aurum Low Stringency Wash | Stampi base Bio-Rad | 7326804 | |
| (per inclusione) | Tissue-Tek | 4122 | |
| BD Precision Glide Ago 21g x 1 1/2" | Becton Dickinson | 305167 | |
| C1000 Touch Termociclatore | Bio-Rad | 1840148 | |
| Provette per microcentrifuga senza tappo 2 mL | Fisherbrand | 02-681-453 | |
| Centrifuga | Eppendorf | 5430R | |
| CFX Opus 96 Strumento per PCR in tempo reale | Bio-Rad | 12011319 | |
| Cloroformio | Thermo Scientific Chemicals | 383760010 | |
| Cytoseal 60 Mezzo di montaggio a bassa viscosità | Epredia | 83104 | |
| Acqua trattata con DEPC | Ambion | AM 9906 | |
| Microscopio da dissezione | Nikon | ||
| Soluzione di diluizione della DNasi | Bio-Rad | 7326805 | |
| DNasi I | Bio-Rad | 7326828 | |
| dNTP Soluzione di | Invitrogen | 18427013 | |
| Bio-Rad | 7326801 | ||
| EM 400 paraffina media incorporante | Leica Biosystems | 3801320 | |
| Eosina Y (0,5% p/v) | RICCA | 2858-16 | |
| Formula R Mezzo di infiltrazione paraffina | Leica Biosystems | 3801470 | |
| Genemark Nutator Gyromixer 349 | Bio Express | S-3200-2 | |
| Gill #3 Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS332-1L | |
| HCl (per HCL-Etanolo) | Fisher Chemical | A142212 | |
| IP VI Cassette di inclusione | Leica Biosystems | 39LC-550-5-L | |
| Etanolo puro Koptec - 200 Proof (per il 70% di etanolo) | Decon Labs | V1001 | |
| MgCl2 (25 mM) | Thermo Fisher Scientific | R0971 | |
| Provette per microcentrifuga 1,7 mL | Avantor | 87003-294 | |
| Guarnizioni Microseal 'B' (guarnizioni adesive) | Bio-Rad | MSB1001 | |
| Microtomo | Leica Biosystems | RM2245 | |
| Grado di biologia molecolare | Corning | 46-000-CM | |
| Mortaio Coors Tek | Thomas Scientific | 60310 | |
| NaCl (per soluzione salina allo 0,85%) | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
| Spettrofotometro | NanoDrop Tecnologie NanoDrop | ND-1000 UV/Vis | |
| Oligo dT | Invitrogen | 18418020 | |
| Sezione di paraffina Bagno di galleggiamento | Boekel Scientific | 14792V | |
| Paraformaldeide (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | |
| PCR Tube Strip | Avantor | 76318-802 | |
| Pestello di Coors Tek | Thomas Scientific | 60311 | |
| Pestello Motore a pellet | Kimble | 749540-0000 | |
| Soluzione salina tampone fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Precision Model 19 Forno a vuoto | Thermo Fisher Scientific | CAT# 51221162 | |
| Primer: 36B4 (avanti) 10 μ M 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3' | Chen lab Oligo database | ||
| Primer: 36B4 (inverso) 10 μ M 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3' | Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Fabp4 (avanti) 10 μ M 5' ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3' | Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Fabp4 (inverso) 10 μ M 5' CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3' | Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Glut 4 (primer in avanti) 10 μ M 5' CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3' | Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Glut 4 (inverso) 10 μ M 5' GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3' | Chen lab Oligo database | ||
| Primer: PPARg (avanti) 10 μ M 5' AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3' | Chen lab Oligo database | ||
| Primer: PPARg (riserva) 10 μ M 5' AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3' | Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ppargc1a (inverso) 10 μ M 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3' | Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ppargc1a(avanti) 10 μ M 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3' | Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ucp1 (avanti) 10 μ M 5' AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3' | Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ucp1 (inverso) 10 μ M 5' ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3' | Chen lab Oligo database | ||
| di isolamento dell'RNA (PureZol) | Bio-Rad | 7326880 | |
| RNase Away (decontaminante superficiale) | Thermo Scientific | 1437535 | |
| RNasi H | NEB | M0297S | |
| Inibitore della RNasi (RNase Out) | Invitrogen | 10777019 | |
| Fiala di scintillazione (vetro) | Microscopia elettronica Sciences | 72632 | |
| Banco di asciugatura vetrini | Elettrotermico (Cole-Parmer) | MH6616 | |
| Rack di colorazione in acciaio inox | Microscopia elettronica Scienze | 70312-54 | |
| Stereomicroscopio (per inclusione) | Olympus | SZ51 | |
| Forbici sugiche | McKesson | 43-1-104 | |
| Pinza da dissezione diritta a punta superfine | Avantor | 82027-402 | |
| Superfrost Plus Vetrini per microscopio | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| trascrittasi inversa in apice III (include 5 tamponi del primo filamento e 0,1 M DTT) | Siringa Invitrogen | 18080044 | |
| SUR-VET con ago 25 G x 5/8", 1 mL | Terumo | 100281 | |
| SYBR Green (miscela master enzimatica qPCR) | Applied Biosystems | A25778 | |
| Tissue-Tek Manual Dyling Coloring Set (barattoli) | Scienze della microscopia elettronica | SKU: 62540-01 | |
| Toluene | Fisher Chemical | T324-1 | |
| Pipetta di trasferimento | Avantor | 414004-005 | |
| Xilene | Fisher Chemical | X3P-1GAL |
Riferimenti
- Boutari, C., Mantzoros, C. S. A 2022 update on the epidemiology of obesity and a call to action: as its twin COVID-19 pandemic appears to be receding, the obesity and dysmetabolism pandemic continues to rage on. Metabolism. 133, 155217(2022).
- Hales, C. M., Carroll, M. D., Fryar, C. D., Ogden, C. L.
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Ristampe e permessi
