Summary
Questo articolo presenta una guida per il campionamento di sei organi significativi e diversi in Xenopus adulto a cui è possibile accedere rapidamente e facilmente: il ventricolo cardiaco, il lobo del fegato, il pancreas, i corpi adiposi, i reni accoppiati e la pelle.
Abstract
Xenopus è stato un potente organismo modello per comprendere lo sviluppo e le malattie dei vertebrati per oltre cento anni. Mentre le tecniche sperimentali di analisi e dissezione dell'embrione sono state ben documentate, le descrizioni delle strutture e degli organi di Xenopus adulto, insieme alle tecniche per lavorare con gli adulti, non sono state aggiornate per prendere in considerazione i requisiti di approcci moderni come la proteomica quantitativa e la trascrittomica a singola cellula. Le prospettive gene-centrici e del tipo cellulare richiedono osservazioni contrastanti negli stadi embrionali con quelle nei tessuti adulti. Gli organi della larva subiscono cambiamenti significativi nella loro struttura complessiva, morfologia e posizione anatomica lungo tutta la transizione larvale verso l'adulto, in particolare durante il rimodellamento della metamorfosi massiva. Stabilire standard solidi per l'identificazione e la dissezione degli organi è fondamentale per garantire che i set di dati risultanti dagli studi eseguiti in diversi laboratori possano essere coerenti. Il presente protocollo identifica sei degli organi dello Xenopus adulto, dimostrando i metodi per la dissezione e il campionamento del ventricolo cardiaco, del fegato, del corpo adiposo, del pancreas, del rene accoppiato e della pelle dello Xenopus adulto. A seconda dei metodi di conservazione, gli organi sezionati possono essere utilizzati per la proteomica quantitativa, la trascrittomica di singole cellule/nuclei, l'ibridazione in situ , l'immunoistochimica, l'istologia, ecc. Questo protocollo mira a standardizzare il campionamento dei tessuti e a facilitare le indagini multi-laboratorio dei sistemi di organi adulti.
Introduction
Sebbene sia disponibile la "dissezione digitale di Xenopus adulto" 1, il campionamento replicabile di organi e tessuti di Xenopus adulto rimane impegnativo senza le istruzioni dettagliate disponibili per altri modelli adulti (ad es. topi 2,3,4). Questo articolo mira a fornire una guida chiara per un campionamento accurato e replicabile degli organi di Xenopus adulti, simile a quello attualmente disponibile per le loro larve5. L'accento è posto sulla facilità di completamento per mantenere la massima freschezza e rendere il protocollo accessibile a tutti gli utenti.
Sebbene esista una guida completa alla dissezione per Rana sp.6, così come numerose guide alla dissezione in classe per altri anuri7, attualmente non è disponibile alcuna guida alla dissezione e al campionamento di Xenopus. Per coloro che non hanno familiarità con le pratiche di campionamento o l'anatomia degli anfibi, le piccole differenze tra Xenopus e altri anuri rendono queste risorse non ottimali per il campionamento di tessuti replicabili.
Molti tessuti preziosi non sono inclusi e sono addirittura scartati nella presente guida; Questo per garantire la freschezza dei tessuti. Sei campioni sono abbastanza limitati da garantire che questi tessuti possano essere raccolti in meno di un'ora dopo che il cuore inizia a battere, indipendentemente dall'esperienza o dal livello di abilità dell'utente. Guide più avanzate e dettagliate per la raccolta di molti altri tessuti sono in preparazione come documenti di accompagnamento separati.
Per gli utenti meno esperti, si raccomanda sempre di tentare questo protocollo sugli animali sottoposti a eutanasia per motivi diversi dalla sperimentazione prima di campionare qualsiasi animale difficile da sostituire (ad esempio, transgenici, animali di età avanzata, ecc.). Idealmente, tutti gli animali campionati saranno sani e, se femmine, non saranno stati ovulati nelle ultime due settimane.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le norme e i regolamenti della Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3). I risultati rappresentativi sono mostrati sia per un maschio adulto di albino perfuso che non perfuso, Xenopus laevis.
1. Preparazione sperimentale
NOTA: Se si segue il protocollo di perfusione8 prima del campionamento, andare al passaggio 2.2.
- Assicurarsi che l'istituto di ricerca abbia approvato la tecnica di eutanasia descritta nel presente protocollo.
- Preparare una soluzione di 5 g/L di MS-222 (tricaina metansolfonato) e 5 g/L di bicarbonato di sodio (vedi Tabella dei materiali). Il volume deve essere superiore al volume necessario per coprire completamente gli animali da sopprimere. Controllare il pH per assicurarsi che sia ≥7.
- Eseguire l'eutanasia primaria inserendo lo Xenopus nella soluzione di eutanasia; L'animale rimarrà immerso per un totale di 1 h.
- Impostare la stazione di dissezione in modo che, subito dopo il prelievo, tutti i tessuti possano essere risciacquati in PBS refrigerato o PBS9 0,7x (a seconda delle esigenze sperimentali), controllati e tagliati sotto una luce con ingrandimento 5x (o superiore). Questa stazione deve anche consentire all'utente di sostituire tutte le pinze e le forbici o di pulirle tra un utilizzo e l'altro.
- Una volta che la rana è rimasta nella soluzione per 1 ora, l'eutanasia primaria è stata completata. Rimuovere la rana e controllare la perdita di risposta al dolore eseguendo un pizzicamento del piede.
- Registrare i dettagli appropriati per l'animale, come specie, ceppo, sesso, età e stato di salute, nonché se è stato perfuso. Pesare lo Xenopus e prendere eventuali misure aggiuntive, come la lunghezza del muso e dello sfiato.
- Posiziona la rana sul dorso e fissa gli arti prossimali al corpo (Figura 1).
- Usando le forbici da dissezione, taglia la pelle, lungo la linea mediana e poi lateralmente, facendo due lembi.
- Facendo riferimento alla Figura 2, identificare la linea alba e utilizzare una pinza per afferrarla ed estrarla dalla cavità celomica. Taglia con cura la muscolatura usando le forbici. Fai due lembi dalla parete della cavità. Taglia o appunta tutti i lembi in modo che non siano d'intralcio.
- Identifica il cuore che continuerà a battere. Utilizzare le forbici da dissezione per ridurre le ossa coracoidee (Figura 2) per ottenere un migliore accesso al cuore.
NOTA: Se il cuore ha smesso di battere prima del prelievo, si noti che la freschezza del campione è stata compromessa.
2. Campionamento
NOTA: Se l'animale è stato perfuso, andare al passaggio 2.2.
- Identificare il pericardio sottile e tenderlo con una pinza per tessuti (Figura 3).
- Utilizzando la punta delle forbici per iridectomia, perforare delicatamente il pericardio, facendo attenzione a non tagliare i tessuti sottostanti. Staccare il pericardio dalle 3 camere del cuore.
- Usa una pinza per afferrare il ventricolo per l'apice, identifica il punto in cui si attacca ai padiglioni auricolari e al tronco arterioso (Figura 4) e taglialo sotto questi attacchi (Figura 5). Se necessario, tagliare il ventricolo in modo che non siano visibili tessuti dei padiglioni auricolari o del tronco arterioso e che il tessuto valvolare di colore chiaro sia ancora visibile all'interno del ventricolo.
NOTA: Negli animali non perfusi, la rimozione del ventricolo può qualificarsi come eutanasia secondaria. - I 3 lobi del fegato saranno visibili (Figura 6 e Figura 7). Afferrare il labbro del lobo sinistro (alla destra dell'osservatore) e sollevarlo delicatamente in modo che i dotti epatici e cistici siano visibili (Figura 8). Campionare il 1/3 inferiore del lobo sotto questi attacchi (Figura 9).
- Per ottenere un migliore accesso ai tessuti di una rana femmina, è utile rimuovere l'ovaio. Identificare l'ovaio che è avvolto in uno strato di peritoneo viscerale chiamato epitelio germinale. Spostare delicatamente i lobi fino a quando non si trovano sui rispettivi lati per rendere visibile l'area di attacco (Figura 10). Questi attacchi sono direttamente ventrali al rene accoppiato.
- Usando le forbici, rimuovere le ovaie il più vicino possibile ai reni senza danneggiarli (Figura 11).
- Ispezionare il lobo mediale (chiamato anche lobo anteriore) del fegato e notare come si collega allo stomaco e al duodeno attraverso il mesentere e il dotto epatopancreatico (chiamato anche dotto biliare comune) (Figura 6, Figura 7 e Figura 8).
- Recidere il mesentere, il legamento epatoduodenale usando le forbici per iridectomia e il dotto epatopancreatico dove incontra il duodeno. Recidere la connessione del pancreas e del dotto epatopancreatico al lobo mediale del fegato in modo che non si attacchi tessuto epatico scuro (Figura 12).
- Afferrare lo stomaco con una pinza dentata e l'estremità superiore del pancreas con una pinza per tessuti. Con un ingrandimento di 5x, stuzzicare delicatamente il pancreas dallo stomaco (Figura 13).
NOTA: Se non viene via in modo pulito, il tessuto pancreatico rimanente sarà visibile e può essere rimosso in frammenti. In alternativa, il pancreas può essere metodicamente staccato utilizzando le forbici per iridectomia e le pinze per tessuti. - Facendo riferimento alla Figura 14A, identificare la vescica urinaria e rimuoverla, tagliando il più vicino possibile alla cloaca. Scartare questo fazzoletto.
- Facendo riferimento alla Figura 14B, identificare l'intestino crasso e tenderlo per recidere l'intestino crasso il più vicino possibile alla cloaca. Rimuovere e scartare l'intero canale alimentare, recidendo il peritoneo dove si attacca alla milza. I corpi adiposi saranno ora completamente accessibili.
- Separa i corpi grassi in modo che siano sui rispettivi lati. L'area sopra il rene, dove il corpo adiposo si collega al peritoneo, sarà visibile. Afferra la base del corpo grasso sinistro (alla destra dell'osservatore) e usa le forbici per tagliarlo via dal peritoneo, lasciando un piccolo margine in modo che il rene non venga danneggiato (Figura 15).
- Rimuovere e scartare il corpo grasso rimasto. I reni accoppiati saranno ora completamente visibili.
- Nelle femmine di rana o nei maschi con ovidotti vestigiali distinti, afferrare un ovidotto e tirarlo via dal rene e dalla cloaca (Figura 16). Taglia l'ovidotto dove incontra la cloaca e continua a tirarla via dal rene, tagliando tutti gli attacchi peritoneali chiari non appena diventano evidenti. Scartare questo fazzoletto.
- Ripetere questo processo con l'ovidotto rimanente.
- I reni sono ancora ricoperti da un peritoneo chiaro (retroperitoneale)10. Usa il forcipe per afferrare i reni e recidere il peritoneo alla loro estremità inferiore.
- Sollevare i reni dalla cavità celomica, usando le forbici per recidere il peritoneo il più vicino possibile ai reni senza danneggiarli (Figura 17).
- Con un ingrandimento 5x, tagliare il peritoneo in eccesso e qualsiasi altro tessuto rimanente (corpi adiposi, milza). Se la rana è femmina, assicurarsi che il tessuto ovarico rimanente venga rimosso (Figura 18). Se la rana è maschio, rimuovere con cautela il testicolo e verificare la presenza di un ovidotto vestigiale, che potrebbe non essere visibile senza ingrandimento (Figura 19).
- Rimuovi i perni dall'animale, capovolgilo sul suo ventre e riappunta gli arti dell'animale.
- Seleziona uno degli arti posteriori da cui campionare e appunta il piede di quell'arto.
- Rimuovere un lembo di pelle a mandorla da sopra il gastrocnemio/tibiofibula (Figura 20).
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Representative Results
Utilizzando le Figure 1 e 20 e seguendo tutti i passaggi di questo protocollo, il ventricolo cardiaco, il lobo sinistro del fegato, il pancreas, i corpi adiposi sinistri, i reni accoppiati e un lembo di pelle sono stati asportati in modo pulito entro un'ora dall'eutanasia. Entro questo periodo, i campioni vengono risciacquati e tagliati in modo che appaiano, come mostrato nella Figura 21.
Figura 1: Xenopus appuntato. Una femmina matura di X. tropicalis si inchiodava attraverso ogni arto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Parete addominale. La pelle ventrale di una femmina di X. tropicalis è tagliata in lembi, rendendo visibili la linea alba e le ossa coracoidi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Cuore chiuso nel pericardio. L'apice del ventricolo cardiaco viene afferrato attraverso il pericardio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Ventricolo cardiaco e tronco arterioso. Il ventricolo di una X laevis perfusa, afferrato, mostrando il suo attaccamento al tronco arterioso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Diagramma cardiaco. Un diagramma delle strutture rilevanti del cuore con una linea tratteggiata che indica dove campionare il ventricolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Diagramma epatopancreatico. Un diagramma dei 3 lobi del fegato, del pancreas e degli organi associati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Organi epatopancreatici. Un maschio albino perfuso di X. laevis con 3 lobi di fegato, pancreas e organi associati etichettati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Dotti cistici ed epatici. Il lobo sinistro del fegato viene sollevato per mostrare i dotti cistico ed epatico in X. laevis perfuso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: Prelievo epatico. Il lobo epatico sinistro di un X. tropicalis non perfuso è reciso sotto gli attacchi dei dotti epatici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 10: Attacco ovarico. Con i lobi ovarici sui rispettivi lati, è visibile la continuità dell'epitelio germinale con la parete peritoneale (sopra i reni). Due linee tratteggiate bianche indicano dove recidere questi allegati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 11: Rimozione delle ovaie. L'ovaio di un X. laevis non perfuso viene estratto dai reni accoppiati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 12: Incisioni di mesenteria. La cavità celomica di un X. laevis non perfuso, a seguito del prelievo del ventricolo cardiaco e del lobo sinistro del fegato, nonché della rimozione dell'ovaio. Una linea tratteggiata bianca indica dove recidere il legamento epatopancreatico e il dotto, mentre una linea tratteggiata verde indica dove recidere il pancreas dal lobo mediale del fegato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 13: Campionamento del pancreas. Il pancreas di un X. laevis non perfuso viene preso in giro dallo stomaco. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 14: Prelievo di organi. (A) La vescica urinaria di un X. laevis non perfuso viene estratta dalla cloaca con una linea tratteggiata che indica dove tagliarla. (B) L'intestino crasso di uno X. laevis non perfuso viene estratto dalla cloaca con una linea tratteggiata che indica dove reciderlo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 15: Campionamento dei corpi grassi. I corpi adiposi, attaccati al peritoneo all'estremità superiore dei reni accoppiati, vengono estratti dalla cavità celomica con una linea tratteggiata che mostra dove tagliarli. Si noti che adiacente a questo attacco, questo maschio di X. tropicalis ha 1 testicolo e un paio di ovidotti vestigiali distinti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 16: Rimozione dell'ovidotto. L'ovidotto di un X. laevis perfuso viene tirato via dal rene accoppiato, rendendo visibile il peritoneo chiaro. Una linea tratteggiata indica dove incidere il peritoneo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 17: Campionamento dei reni. I reni accoppiati di un X. laevis non perfuso vengono sollevati dalla cavità celomica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 18: Taglio del rene. (A) Una vista ventrale del rene accoppiato di una femmina non perfusa di X. laevis con organi peritoneali associati attaccati. (B) Lo stesso rene con gli organi associati rimossi ma con un po' di tessuto peritoneale rimanente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 19: Rimozione del testicolo. I reni accoppiati di X. tropicalis non perfuso con un testicolo rimosso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 20: Prelievo cutaneo. (A) La zampa destra di X. tropicalis con una linea tratteggiata che indica l'area della pelle da campionare. (B) La zampa destra di un X. tropicalis con un campione di pelle rimosso sopra la tibiofibula. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 21: Risultati rappresentativi del campionamento di organi. Campioni di cuore, ventricolo, fegato, pancreas, corpo grasso, rene accoppiato e pelle prelevati da un albino X . laevis perfuso e non perfuso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Poiché questo protocollo mira a massimizzare la freschezza, alcuni campioni possono includere tessuti indesiderati. Ad esempio, il dotto epatopancreatico e alcuni mesenteri vengono campionati con il pancreas e alcuni tessuti peritoneali, ghiandole surrenali e ureteri saranno sempre campionati con i reni accoppiati. Se la freschezza non è un problema, è possibile ottenere un campionamento più preciso utilizzando tecniche modificate.
L'aspetto e la posizione degli organi sono comparabili tra i sessi e le specie di Xenopus. Tuttavia, il colore dei tessuti varia in modo significativo a seconda che gli animali siano stati perfusi o meno. È per questo motivo che sono incluse immagini di animali sia perfusi che non perfusi.
Un vincolo di questo protocollo è che la velocità e la riproducibilità sono prioritarie rispetto alla raccolta di campioni che rappresentano al meglio l'interezza del tessuto desiderato. Ad esempio, la sezione del lobo sinistro del fegato qui campionata non può rappresentare adeguatamente tutti e tre i lobi del tessuto epatico. In caso di errori nel campionamento, le opzioni per la risoluzione dei problemi sono influenzate dal potenziale di variazione tra le diverse sezioni di tessuto. Ad esempio, non è noto se il lobo destro del fegato, il corpo grasso destro o una diversa porzione di pelle sarebbero alternative funzionali ai tessuti desiderati. In questi casi, si dovrebbe usare discrezione, in base alle esigenze della ricerca, prima di sostituire sezioni di tessuto.
Un'altra limitazione di questo protocollo è che se gli animali sottoposti a campionamento presentano difetti anatomici drastici o problemi di salute clinicamente significativi, gli organi nella cavità celomica potrebbero non apparire come descritto qui. Granulomi sono stati trovati nei tessuti di rane infettate da Mycobacterium spp.11,12 e precedenti casi di sindrome da iperstimolazione ovarica sembrano portare a una presentazione anomala degli organi13.
Sebbene questo metodo sia stato sviluppato per il laboratorio Xenopus, ci sono somiglianze significative nell'aspetto di questi organi all'interno di molti anfibi non cecili e rettili con arti14. La parte di campionamento di questo protocollo potrebbe essere facilmente modificata per altri modelli, come gli axolotl o l'anolo verde.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione OD del NIH R24OD031956. Ringraziamo Samantha Jalbert, Jill Ralston e Cora Anderson per la loro assistenza e supporto, nonché il nostro editore e i revisori anonimi per il loro utile feedback
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x Magnifying Glass with LED Light and Stand | amazon.com | B08QJ6J8P1 | light must not produce heat |
| Disposable Transfer Pipets | VWR | 414004-036 | |
| Dissecting Fine-Pointed Forceps | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Dissection Tray | Fisher Scinetific | 14-370-284 | styrofoam sheets are an acceptable alternative |
| Euthanasia container | US Plastic | Item 2860 | alternative opaque containers acceptable |
| Euthanasia container lid | US Plastic | Item 3047 | |
| Iridectomy Scissors 6" | vwr | 470018-938 | iris scissors are an acceptable alternative |
| MS-222: Syncaine (formerly tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Sodium Bicarbonate, Powder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Specimen Forceps, Serrated | VWR | 82027-442 | |
| T-Pins for Dissecting | Fisher Scinetific | S99385 |
References
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