Summary
В этой статье представлено руководство по выборке шести важных и разнообразных органов у взрослого Xenopus , к которым можно быстро и легко получить доступ: желудочек сердца, доля печени, поджелудочная железа, жировые тела, парные почки и кожа.
Abstract
Xenopus уже более ста лет является мощным модельным организмом для понимания развития и болезней позвоночных. В то время как методы экспериментального анализа и препарирования эмбриона хорошо задокументированы, описания структур и органов Xenopus взрослого человека, а также методы работы со взрослыми особями не были обновлены с учетом требований таких современных подходов, как количественная протеомика и транскриптомика одиночных клеток. Клеточный тип и геноцентрические перспективы требуют сопоставления наблюдений на эмбриональных стадиях с наблюдениями во взрослых тканях. Органы личинки претерпевают значительные изменения в своей общей структуре, морфологии и анатомическом расположении на всем протяжении перехода от личинки к взрослой особи, особенно во время массивного ремоделирования метаморфоза. Установление надежных стандартов для идентификации и препарирования органов имеет решающее значение для обеспечения согласованности наборов данных, полученных в результате исследований, проведенных в различных лабораториях. В настоящем протоколе определены шесть органов у взрослого Xenopus, демонстрируются методы вскрытия и взятия проб из желудочка сердца, печени, жирового тела, поджелудочной железы, парной почки и кожи взрослого Xenopus. В зависимости от методов консервации, препарированные органы могут быть использованы для количественной протеомики, транскриптомики одиночных клеток/ядер, гибридизации in situ , иммуногистохимии, гистологии и т.д. Этот протокол направлен на стандартизацию отбора образцов тканей и облегчение многолабораторных исследований систем органов взрослого человека.
Introduction
Несмотря на то, что «цифровое вскрытие» взрослого Xenopus доступно1, воспроизводимый образец органов и тканей взрослого Xenopus остается сложной задачей без подробной инструкции, доступной для других взрослых моделей (например, мышей 2,3,4). Цель этой статьи — предоставить четкое руководство по точному и воспроизводимому отбору проб органов взрослых особей Xenopus, аналогичному тому, который в настоящее время доступен для их личинок5. Акцент сделан на простоте заполнения, чтобы сохранить максимальную актуальность и сделать протокол доступным для всех пользователей.
Несмотря на то, что существует подробное руководство по вскрытию для Rana sp.6, а также многочисленные руководства по вскрытию в классе для других бесхвостых7, в настоящее время не доступно руководство по вскрытию и взятию образцов Xenopus. Для тех, кто не знаком с практикой отбора проб или анатомией амфибий, небольшие различия между Xenopus и другими бесхвостыми делают эти ресурсы неоптимальными для воспроизводимых образцов тканей.
Многие ценные ткани не включены и даже отброшены в данном руководстве; Это необходимо для обеспечения свежести тканей. Шесть образцов достаточно ограничены, чтобы гарантировать, что эти ткани могут быть собраны менее чем через час после того, как сердце начнет биться, независимо от опыта или уровня квалификации пользователя. Более продвинутые и подробные руководства по сбору многих других тканей находятся в стадии подготовки в виде отдельных сопутствующих документов.
Для менее опытных пользователей всегда рекомендуется сначала опробовать этот протокол на животных, которых усыпляют по причинам, отличным от экспериментов, прежде чем брать образцы любых животных, которых трудно заменить (т.е. трансгенных животных, животных преклонного возраста и т.д.). В идеале, все отобранные животные должны быть здоровыми, а если это самки, то овуляция не должна происходить в течение последних двух недель.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты проводились в соответствии с правилами и нормами Гарвардской медицинской школы IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3). Репрезентативные результаты показаны как для перфузированного, так и для неперфузионного самца взрослого альбиноса Xenopus laevis.
1. Подготовка к эксперименту
ПРИМЕЧАНИЕ: Если перед отбором проб соблюдается протоколперфузии 8 , перейдите к шагу 2.2.
- Убедитесь, что научно-исследовательское учреждение одобрило методику эвтаназии, описанную в этом протоколе.
- Приготовьте раствор из 5 г/л MS-222 (трикаина метансульфоната) и 5 г/л гидрокарбоната натрия (см. Таблицу материалов). Объем должен быть больше объема, необходимого для полного покрытия животных, подлежащих усыплению. Проверьте pH, чтобы убедиться, что он составляет ≥7.
- Провести первичную эвтаназию путем помещения Xenopus в раствор для эвтаназии; Животное будет оставаться под водой в общей сложности 1 час.
- Настройте станцию вскрытия таким образом, чтобы сразу после взятия проб все ткани можно было промыть в охлажденном PBS или 0,7x PBS9 (в зависимости от экспериментальных потребностей), проверить и обрезать под светом с 5-кратным (или большим) увеличением. Эта станция также должна позволять пользователю либо заменять все щипцы и ножницы, либо протирать их между использованиями.
- После того, как лягушка пробыла в растворе 1 ч, первичная эвтаназия была завершена. Удалите лягушку и проверьте потерю болевой реакции, выполнив щиплет ногой.
- Запишите соответствующие данные о животном, такие как вид, штамм, пол, возраст и состояние здоровья, а также о том, было ли оно перфузировано. Взвесьте Xenopus и выполните дополнительные измерения, такие как длина рыла и вентиляционного отверстия.
- Положите лягушку на спину и прижмите конечности проксимальнее тела (рисунок 1).
- С помощью ножниц для рассечения разрежьте кожу вверх по средней линии, а затем сбоку, сделав два лоскута.
- Как показано на рисунке 2, определите белую линию и с помощью щипцов захватите ее и оттяните от целомической полости. Аккуратно разрежьте мускулатуру ножницами. Сделайте две заслонки из стенки полости. Отрежьте или приколите все клапаны в сторону.
- Определите сердце, которое все еще будет биться. Используйте ножницы для препарирования, чтобы уменьшить коракоидные кости (Рисунок 2), чтобы получить лучший доступ к сердцу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если сердце перестало биться перед взятием пробы, следует отметить, что свежесть образца была нарушена.
2. Отбор проб
ПРИМЕЧАНИЕ: Если животное было перфузировано, перейдите к шагу 2.2.
- Определите тонкий перикард и подтяните его с помощью тканевых щипцов (рисунок 3).
- С помощью кончика ножниц для иридэктомии аккуратно проделайте перфорацию перикарда, стараясь не порезать подлежащие ткани. Отшлифуйте перикард вверх от 3 камер сердца.
- С помощью щипцов захватите желудочек за верхушку, определите, где он прикрепляется к ушным раковинам и артериальному стволу (рисунок 4), и разрежьте его ниже этих прикреплений (рисунок 5). При необходимости обрезайте желудочек так, чтобы не было видно тканей из предсердий или артериального ствола, а внутри желудочка все еще была видна светлая ткань клапана.
Примечание: У животных без перфузии удаление желудочка может быть квалифицировано как вторичная эвтаназия. - Будут видны 3 доли печени (Рисунок 6 и Рисунок 7). Возьмитесь за губу левой доли (справа от наблюдателя) и осторожно приподнимите ее так, чтобы были видны печеночные и пузырные протоки (рисунок 8). Возьмите образец из нижней 1/3 лопасти ниже этих насадок (Рисунок 9).
- Чтобы получить лучший доступ к тканям самки лягушки, полезно удалить яичник. Определите яичник, который покрыт слоем висцеральной брюшины, называемой зародышевым эпителием. Аккуратно сдвиньте лепестки, пока они не окажутся на своих сторонах, чтобы сделать видимой область прикрепления (Рисунок 10). Эти прикрепления находятся непосредственно вентрально по отношению к парной почке.
- С помощью ножниц удалите яичники как можно ближе к почкам, не повреждая их (рисунок 11).
- Осмотрите медиальную долю печени (также называемую передней долей) и обратите внимание, как она соединяется с желудком и двенадцатиперстной кишкой через брыжеечный и гепатопанкреатический проток (также называемый общим желчным протоком) (рис. 6, рис. 7 и рис. 8).
- Разрежьте брыжейку, гепатодуоденальную связку с помощью иридэктомических ножниц, а также гепатопанкреатический проток там, где он встречается с двенадцатиперстной кишкой. Разорвите соединение поджелудочной железы и гепатопанкреатического протока с медиальной долей печени так, чтобы не прикреплялась темная ткань печени (рис. 12).
- Обхватите живот зубчатыми щипцами и верхний конец поджелудочной железы тканевыми щипцами. При 5-кратном увеличении осторожно дразните поджелудочную железу от живота (Рисунок 13).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если он не отделится чисто, оставшаяся ткань поджелудочной железы будет видна и может быть отделена фрагментами. В качестве альтернативы поджелудочная железа может быть методично отделена с помощью иридэктомических ножниц и тканевых щипцов. - Обратившись к рисунку 14А, определите мочевой пузырь и удалите его, разрезав как можно ближе к клоаке. Выбросьте эту салфетку.
- Обратившись к рисунку 14B, определите толстую кишку и натяните ее, чтобы разрезать толстую кишку как можно ближе к клоаке. Удалите и выбросьте весь пищеварительный канал, перерезав брюшину, где она прикрепляется к селезенке. Теперь полные тела будут полностью доступны.
- Раздразните толстые тела так, чтобы они оказались на своих сторонах. Область над почкой, где жировое тело соединяется с брюшиной, будет видна. Возьмитесь за основание левого жирового тела (справа от зрителя) и ножницами отрежьте его от брюшины, оставив небольшой запас, чтобы почка не была повреждена (рисунок 15).
- Удалите и отбросьте остатки жировой ткани. Теперь парные почки будут полностью видны.
- У самок лягушек или самцов с отчетливыми рудиментарными яйцеводами возьмите яйцевод и оттяните его от почки и клоаки (рис. 16). Разрежьте яйцевод в том месте, где он встречается с клоакой, и продолжайте оттягивать его от почки, обрезая все прозрачные брюшинные прикрепления по мере их становления очевидными. Выбросьте эту салфетку.
- Повторите этот процесс с оставшимся яйцеводом.
- Почки по-прежнему покрыты прозрачной брюшиной (забрюшинной)10. С помощью щипцов захватите почки и разрежьте брюшину на их нижнем конце.
- Поднимите почки из целомической полости, используя ножницы, чтобы разрезать брюшину как можно ближе к почкам, не повреждая их (Рисунок 17).
- При 5-кратном увеличении отрежьте лишнюю брюшину и любые другие оставшиеся ткани (жировые тела, селезенку). Если лягушка самка, убедитесь, что вся оставшаяся ткань яичника удалена (Рисунок 18). Если лягушка самец, осторожно удалите яичко и проверьте наличие рудиментарного яйцевода, который может быть не виден без увеличения (Рисунок 19).
- Извлеките булавки из животного, наденьте его на вентиляционное отверстие и снова приколите конечности животного.
- Выберите любую заднюю конечность для образца и приколите ногу этой конечности.
- Удалите миндалевидный лоскут кожи над икроножной мышцей/большеберцовой мышцей (рисунок 20).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя рисунки с 1 по 20 и следуя всем шагам этого протокола, желудочек сердца, левая доля печени, поджелудочная железа, левые жировые тела, парные почки и лоскут кожи были аккуратно иссечены в течение часа после эвтаназии. В течение этого времени образцы промывают и обрезают, чтобы они выглядели, как показано на рисунке 21.
Рисунок 1: Закрепленный Xenopus. Половозрелая самка X. tropicalis пронзила каждую конечность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: Брюшная стенка. Брюшная кожа самки X. tropicalis разрезана на лоскуты, что делает видимыми белую линию и коракоидные кости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3: Сердце, заключенное в перикард. Верхушка сердечного желудочка захватывается через перикард. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4: Желудочек сердца и артериальный ствол. Желудочек перфузированного X. laevis, будучи захваченным, показывает его прикрепление к артериальному стволу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 5: Диаграмма сердца. Схема соответствующих структур сердца с пунктирной линией, указывающей, где нужно взять пробу желудочка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 6: Диаграмма гепатопанкреатической железы. Схема 3 долей печени, поджелудочной железы и связанных с ними органов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 7: Органы гепатопанкреатической железы. Перфузированный самец-альбинос X. laevis с 3 долями печени, поджелудочной железы и связанных с ними органов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 8: Кистозные и печеночные протоки. Левая доля печени подтягивается, чтобы показать кистозные и печеночные протоки у перфузированного X. laevis. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 9: Забор печени. Левая доля печени неперфузного X. tropicalis разрывается под прикреплениями печеночных протоков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 10: Прикрепление яичников. Когда доли яичников находятся по бокам, видна непрерывность зародышевого эпителия до стенки брюшины (над почками). Две белые пунктирные линии указывают, где следует разорвать эти крепления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 11: Удаление яичников. Завязь неперфузированного X. laevis, оттягивается от парных почек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 12: Разрезы брыжейки. Целомическая полость неперфузированного X. laevis после забора проб из сердечного желудочка и левой доли печени, а также удаления яичника. Белая пунктирная линия указывает на место разрыва гепатопанкреатической связки и протока, в то время как зеленая пунктирная линия указывает на место отделения поджелудочной железы от медиальной доли печени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 13: Отбор проб поджелудочной железы. Поджелудочная железа неперфузионного X. laevis вырывается из желудка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 14: Удаление органа. (А) Мочевой пузырь неперфузированного X. laevis оттягивается от клоаки пунктирной линией, указывающей, где его следует разрезать. (B) Толстая кишка неперфузисного X. laevis оттягивается от клоаки пунктирной линией, указывающей, где ее следует разорвать. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 15: Забор жировых тел. Жировые тела, прикрепленные к брюшине на верхнем конце парных почек, вытягиваются из целомической полости пунктирной линией, указывающей, где их следует разрезать. Обратите внимание, что рядом с этим прикреплением у этого самца X. tropicalis есть 1 яичко, а также пара отчетливых рудиментарных яйцеводов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 16: Удаление яйцевода. Яйцевод перфузированного X. laevis оттягивается от парной почки, делая видимой чистую брюшину. Пунктирной линией обозначено, где нужно надрезать брюшину. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 17: Забор почки из почек.Парные почки неперфузного X. laevis выводятся из целомической полости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 18: Обрезка почек. (A) Вентральный вид парной почки неперфузированной самки X. laevis с прилегающими к ней брюшинными органами. (В) Та же почка с удаленными ассоциированными органами, но с некоторой оставшейся перитонеальной тканью. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 19: Удаление семенника. Парные почки неперфузного X. tropicalis с одним семенником удалены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 20: Забор образцов кожи. (A) Правая нога X. tropicalis с пунктирной линией, обозначающей участок кожи, который должен быть взят для взятия. (B) Правая нога X. tropicalis с образцом кожи, удаленным над большеберцовой костью. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 21: Репрезентативные результаты забора образцов органов. Образцы сердечного желудочка, печени, поджелудочной железы, жирового тела, парной почки и кожи, взятые у перфузированного и неперфузированного альбиноса X. laevis. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Поскольку этот протокол направлен на максимальную свежесть, некоторые образцы могут содержать нежелательные ткани. Например, гепатопанкреатический проток и некоторые брыжейки берутся вместе с поджелудочной железой, а некоторая перитонеальная ткань, надпочечники и мочеточники всегда будут браться с парными почками. Если свежесть не вызывает беспокойства, то более точный отбор проб может быть достигнут с помощью модифицированных методов.
Внешний вид и расположение органов сопоставимы между полами и видами Xenopus. Тем не менее, цвет тканей значительно варьируется в зависимости от того, были ли животные перфузированы. Именно по этой причине в книгу включены изображения как перфузных, так и неперфузированных животных.
Ограничением этого протокола является то, что скорость и воспроизводимость имеют приоритет над сбором образцов, которые наилучшим образом представляют целостность желаемой ткани. Например, срез левой доли печени, взятый здесь, не может адекватно представлять все три доли печеночной ткани. Если при взятии проб есть ошибки, на варианты устранения неполадок влияет вероятность различий между различными участками ткани. Например, неизвестно, будут ли правая доля печени, правильное жировое тело или другая часть кожи функциональными альтернативами желаемым тканям. В этих случаях следует проявлять осмотрительность, исходя из потребностей исследования, прежде чем заменять участки ткани.
Еще одним ограничением этого протокола является то, что если животные, подлежащие отбору проб, имеют серьезные анатомические дефекты или клинически значимые проблемы со здоровьем, органы в целомической полости могут выглядеть не так, как описано здесь. Гранулемы были обнаружены в тканях лягушек, инфицированных Mycobacterium spp.11,12, а предыдущие случаи синдрома гиперстимуляции яичников, по-видимому, приводили к аномальному представлению органов13.
Хотя этот метод был разработан для лабораторных Xenopus, существуют значительные сходства во внешнем виде этих органов у многих амфибий и рептилий с конечностями, не относящихся к цецилиям14. Часть этого протокола, связанная с отбором проб, может быть легко изменена для других моделей, таких как аксолотли или зеленый анол.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом OD R24OD031956 NIH. Мы благодарим Саманту Джалберт, Джилл Ралстон и Кору Андерсон за их помощь и поддержку, а также нашего редактора и анонимных рецензентов за их полезные отзывы
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x Magnifying Glass with LED Light and Stand | amazon.com | B08QJ6J8P1 | light must not produce heat |
| Disposable Transfer Pipets | VWR | 414004-036 | |
| Dissecting Fine-Pointed Forceps | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Dissection Tray | Fisher Scinetific | 14-370-284 | styrofoam sheets are an acceptable alternative |
| Euthanasia container | US Plastic | Item 2860 | alternative opaque containers acceptable |
| Euthanasia container lid | US Plastic | Item 3047 | |
| Iridectomy Scissors 6" | vwr | 470018-938 | iris scissors are an acceptable alternative |
| MS-222: Syncaine (formerly tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Sodium Bicarbonate, Powder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Specimen Forceps, Serrated | VWR | 82027-442 | |
| T-Pins for Dissecting | Fisher Scinetific | S99385 |
References
- Porro, L. B., Richards, C. T. Digital dissection of the model organism Xenopus laevis using contrast-enhanced computed tomography. J Anat. 231 (2), 169-191 (2017).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (23), 91-106 (2003).
- Kittel, B., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--Part 2. A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55, 413-431 (2004).
- Morawietz, G., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice - Part 3 - A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55, 433-449 (2004).
- Patmann, M. D., Shewade, L. H., Schneider, K. A., Buchholz, D. R.
- Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. Dissection of a Frog (Rana sp.). Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 213-263 (2016).
- O'Rourke, D. P. Amphibians used in research and teaching. ILAR J. 48 (3), 183-187 (2007).
- Jonas-Closs, R. A., Peshkin, L. Effective rapid blood perfusion in Xenopus. JoVE. (issue), e65287 (2023).
- Balls, M., Worley, R. S. Amphibian cells in vitro. II. Effects of variations in medium osmolarity on a permanent cells line isolated from Xenopus. Exp Cell Res. 76 (2), 333-336 (1973).
- Holz, P. H., Raidal, S. R. Comparative renal anatomy of exotic species. Vet North Am Exot Anim Pract. 9 (1), 1-11 (2006).
- Trott, K. A., et al. Characterization of a Mycobacterium ulcerans-like infection in a colony of African tropical clawed frogs (Xenopus tropicalis). Comp Med. 54 (3), 309-317 (2004).
- Fremont-Rahl, J. J., et al. Mycobacterium liflandii outbreak in a research colony of Xenopus (Silurana) tropicalis frogs. Vet Pathol. 48 (4), 856-867 (2011).
- Green, S. L., Parker, J., Davis, C., Bouley, D. M. Ovarian hyperstimulation syndrome in gonadotropin-treated laboratory South African clawed frogs (Xenopus laevis). J Am Assoc Lab Anim Sci. 46 (3), 64-67 (2007).
- Vitt, L. J., Caldwell, J. P. Anatomy of amphibians and reptiles. Herpetol. Herpetol. , 35-81 (2009).
