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Bioengineering

एकल-चरण और अर्ध-स्वचालित हेपरिन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी प्रोटोकॉल के माध्यम से एडेनो-जुड़े वायरल वैक्टर का अलगाव

Published: April 5, 2024 doi: 10.3791/66550
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 1,2,4, 1,2,5, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3,6, *1,2,4,5, *1,2,3,4
1CNC-UC - Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 2CIBB - Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology, University of Coimbra, 3IIIUC - Institute for Interdisciplinary Research, University of Coimbra, 4ViraVector - Viral Vectors for Gene Transfer Core Facility, University of Coimbra, 5FFUC - Faculty of Pharmacy, University of Coimbra, 6MICC-CNC - Microscopy Imaging Center of Coimbra - CNC, University of Coimbra
* These authors contributed equally

Summary

यह पांडुलिपि एक अनुकूलित हेपरिन-आधारित आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी विधि का उपयोग करके एडेनो-जुड़े वायरल वैक्टर की पीढ़ी और शुद्धि के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करती है। यह एक सरल, स्केलेबल और लागत प्रभावी दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है, जो अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन की आवश्यकता को समाप्त करता है। परिणामी वैक्टर उच्च शुद्धता और जैविक गतिविधि प्रदर्शित करते हैं, जो प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में उनके मूल्य को साबित करते हैं।

Abstract

एडेनो-जुड़े वायरस (एएवी) विवो जीन वितरण के लिए एक तेजी से मूल्यवान वेक्टर बन गया है और वर्तमान में मानव नैदानिक परीक्षणों से गुजर रहा है। हालांकि, एएवी को शुद्ध करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले तरीके सीज़ियम क्लोराइड या आयोडिक्सानॉल घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करते हैं। उनके फायदे के बावजूद, ये विधियां समय लेने वाली हैं, सीमित मापनीयता है, और अक्सर कम शुद्धता वाले वैक्टर का परिणाम होता है। इन बाधाओं को दूर करने के लिए, शोधकर्ता क्रोमैटोग्राफी तकनीकों पर अपना ध्यान केंद्रित कर रहे हैं। यहां, हम एक अनुकूलित हेपरिन-आधारित आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो एएवी के शुद्धिकरण के लिए एक सार्वभौमिक कैप्चर चरण के रूप में कार्य करता है।

यह विधि हेपरान सल्फेट प्रोटियोग्लाइकेन्स के लिए एएवी सीरोटाइप 2 (एएवी 2) की आंतरिक आत्मीयता पर निर्भर करती है। विशेष रूप से, प्रोटोकॉल एएवी 2 के उन लोगों के साथ वांछित एएवी कैप्सिड प्रोटीन एन्कोडिंग प्लास्मिड के सह-अभिकर्मक पर जोर देता है, मोज़ेक एएवी वैक्टर की उपज देता है जो माता-पिता के दोनों सीरोटाइप के गुणों को जोड़ते हैं। संक्षेप में, उत्पादक कोशिकाओं के लसीका के बाद, एएवी कणों वाले मिश्रण को एक मानक फास्ट प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (एफपीएलसी) प्रणाली का उपयोग करके एक अनुकूलित एकल-चरण हेपरिन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी प्रोटोकॉल के बाद सीधे शुद्ध किया जाता है। शुद्ध एएवी कणों को बाद में केंद्रित किया जाता है और शुद्धता और जैविक गतिविधि के संदर्भ में व्यापक लक्षण वर्णन के अधीन किया जाता है। यह प्रोटोकॉल एक सरलीकृत और स्केलेबल दृष्टिकोण प्रदान करता है जिसे अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन और ग्रेडिएंट की आवश्यकता के बिना किया जा सकता है, जिससे स्वच्छ और उच्च वायरल टाइटर्स मिलते हैं।

Introduction

एडेनो-जुड़े वायरस (एएवी) वेक्टर वर्तमान जीन थेरेपी अध्ययनों में सबसे आशाजनक वितरण प्रणालियों में से एक के रूप में अपना रास्ता जीत रहा है। प्रारंभ में 19651 में पहचाना गया, एएवी एक छोटा, गैर-लिफाफा वाला वायरस है, जिसमें लगभग 25 एनएम व्यास का इकोसाहेड्रल प्रोटीन कैप्सिड होता है, जो एकल-फंसे डीएनए जीनोम को परेशान करता है। एएवी Parvoviridae परिवार और Dependoparvovirus जीनस के लिए एक सहायक वायरस के साथ सह संक्रमण पर उनकी अद्वितीय निर्भरता के कारण हैं, इस तरह के दाद सिंप्लेक्स वायरस या, अधिक बार, adenovirus, उनके lytic चक्र 2,3 को पूरा करने के लिए.

एएवी के 4.7 किलोबेस जीनोम में दो खुले रीडिंग फ्रेम (ओआरएफ) होते हैं जो दो उल्टे टर्मिनल रिपीट (आईटीआर) से घिरे होते हैं जो विशेषता टी-आकार के हेयरपिन सिरोंको बनाते हैं। आईटीआर एएवी पैकेजिंग, प्रतिकृति और एकीकरण के लिए महत्वपूर्ण एकमात्र सीआईएस-अभिनय तत्व हैं, इसलिए पुनः संयोजक एएवी (आरएएवी) वैक्टर में बनाए गए एकमात्र एएवी अनुक्रम हैं। इस प्रणाली में, वेक्टर उत्पादन के लिए आवश्यक जीन को ट्रांस में अलग से आपूर्ति की जाती है, जिससे ब्याज के जीन को वायरल कैप्सिड 5,6 के अंदर पैक किया जा सकता है।

प्रत्येक वायरल जीन वैकल्पिक स्प्लिसिंग के माध्यम से विभिन्न प्रोटीनों को संहिताबद्ध करता है और कोडन शुरू करता है। प्रतिनिधि ओआरएफ के भीतर, चार गैर-संरचनात्मक प्रोटीन (Rep40, Rep52, Rep68, और Rep78) एन्कोडेड हैं, जो प्रतिकृति, साइट-विशिष्ट एकीकरण और वायरल डीएनए 7,8 के एनकैप्सिडेशन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। कैप ओआरएफ अपने एन-टर्मिनस, (वीपी 1, वीपी 2, और वीपी 3) पर एक दूसरे से भिन्न तीन संरचनात्मक प्रोटीनों की अभिव्यक्ति के लिए एक टेम्पलेट के रूप में कार्य करता है, जो 1: 1: 10 4,9 के अनुपात में 60-मेर वायरल कैप्सिड बनाने के लिए इकट्ठा होते हैं। इसके अतिरिक्त, एक गैर-पारंपरिक सीयूजी स्टार्ट कोडन के साथ कैप जीन में नेस्टेड एक वैकल्पिक ओआरएफ एक असेंबली-सक्रिय प्रोटीन (एएपी) को एन्कोड करता है। इस परमाणु प्रोटीन नव संश्लेषित कैप्सिड प्रोटीन VP1-3 के साथ बातचीत और कैप्सिड विधानसभा10,11 को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है.

कैप्सिड खाते के अमीनो एसिड अनुक्रम में अंतर 11 स्वाभाविक रूप से होने वाली एएवी सीरोटाइप और मनुष्यों और गैर-मानव प्राइमेटऊतकों 7,12,13से अलग 100 से अधिक वेरिएंट के लिए खाते हैं। संरचनात्मक रूप से परिवर्तनशील क्षेत्रों के विरूपण में भिन्नताएं विभिन्न उपभेदों से कैप्सिड के विशिष्ट एंटीजेनिक गुणों और रिसेप्टर-बाध्यकारी विशिष्टताओं को नियंत्रित करती हैं। यह अलग ऊतक tropisms और विभिन्न स्तनधारी अंगों14 भर में पारगमन क्षमता में परिणाम.

आरएएवी के प्रारंभिक उत्पादन विधियां सहायक उद्देश्यों 15,16,17,18,19के लिए एडेनोवायरस संक्रमण पर निर्भर थीं। बड़े पैमाने पर कुशल और आमतौर पर उत्पादन करना आसान होने के बावजूद, इस संक्रमण से कई समस्याएं उत्पन्न होती हैं। शुद्धिकरण और निष्क्रियता के लिए एक गर्मी-विकृतीकरण कदम के बाद भी, एडेनोवायरल कण अभी भी एएवी तैयारी में मौजूद हो सकते हैं, जिससे अवांछित सुरक्षा समस्या20 बनती है। इसके अलावा, नैदानिक उपयोग के लिए विकृत एडेनोवायरल प्रोटीन की उपस्थिति अस्वीकार्य है। अन्य उत्पादन रणनीतियों पुनः संयोजक दाद सिंप्लेक्स वायरस उपभेदों का लाभ लेने के लिए इंजीनियर लक्ष्य कोशिकाओं21 या बैकुलोवायरस-कीट सेल प्रणाली22 में प्रतिनिधि / कैप और ट्रांसजीन लाने के लिए इंजीनियर है। यद्यपि ये सिस्टम स्केलेबिलिटी और जीएमपी संगतता के मामले में लाभ प्रदान करते हैं, फिर भी वे समान समस्याओं का सामना करते हैं।

आरएएवी उत्पादन के लिए ट्रिपल अभिकर्मक विधि आमतौर पर इन मुद्दों को आसानी से दूर करने के लिए अपनाई गई है। संक्षेप में, आरएएवी असेंबली तीन प्लास्मिड एन्कोडिंग के साथ कोशिकाओं के क्षणिक अभिकर्मक पर निर्भर करती है: 1) जंगली प्रकार एएवी 2 जीनोम (पीआईटीआर) से आईटीआर के बीच पैक ट्रांसजीन अभिव्यक्ति कैसेट; 2) प्रतिकृति और विषाणु विधानसभा (pAAV-RC) के लिए आवश्यक प्रतिनिधि / कैप अनुक्रम; और 3) हेल्पर प्रभाव (पीहेल्पर)6,20,23के लिए आवश्यक एडेनोवायरस वायरस से जुड़े आरएनए के साथ न्यूनतम एडेनोवायरल प्रोटीन (ई 1 ए, ई 1 बी, ई 4, और ई 2 ए)। जबकि प्लाज्मिड अभिकर्मक विधियां प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में आरएएवी उत्पादन के लिए सादगी और लचीलापन प्रदान करती हैं, इन प्रक्रियाओं में बड़े पैमाने पर उत्पादन पर लागू होने पर स्केलेबिलिटी और प्रजनन क्षमता के संदर्भ में सीमाएं होती हैं। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में, आरएएवी उत्पादन एएवी निर्माता सेल लाइनों (दोनों पालन और निलंबन वृद्धि के) के उपयोग के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, वेक्टर निर्माणों के साथ संयोजन में एएवी प्रतिनिधि / कैप जीन या प्रतिनिधि / कैप को स्थिर रूप से व्यक्त करता है। इन प्रणालियों में, एडेनोवायरल हेल्पर जीन को प्लास्मिड अभिकर्मक के माध्यम से पेश किया जाता है। हालांकि यह रणनीति सेल संस्कृति प्रक्रिया की मापनीयता में सुधार करती है, यह तकनीकी रूप से जटिल और समय लेने वाली 21,24,25है।

किसी भी मामले में, निर्माता कोशिकाओं को तब lysed किया जाता है और एक या कई शुद्धि चरणों के अधीन किया जाता है। वर्तमान में, आरएएवी को शुद्ध करने के प्रमुख तरीकों में सीज़ियम क्लोराइड (सीएससीएल) या आयोडिक्सानॉल अल्ट्रा-हाई स्पीड डेंसिटी ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग क्रोमैटोग्राफी तकनीकों द्वारा किया जाता है या नहीं,26. वायरल वर्षा के लिए मूल शुद्धिकरण योजना में अमोनियम सल्फेट का उपयोग किया गया था, इसके बाद सीएससीएल ढाल के माध्यम से अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के दो या तीन दौर थे। इस प्रक्रिया के मुख्य लाभों में सभी सीरोटाइप को शुद्ध करने की संभावना और उनके विभिन्न घनत्वों के आधार पर खाली कैप्सिड से पूर्ण कणों को शारीरिक रूप से अलग करने की क्षमता शामिल है। हालांकि, यह विधि विस्तृत, समय लेने वाली है, और इसमें सीमित मापनीयता है, जिसके परिणामस्वरूप अक्सर खराब उपज और कम नमूना गुणवत्ता 27,28,29,30होती है। इसके अलावा, एक शारीरिक बफर के खिलाफ डायलिसिस अक्सर विषाक्त प्रभाव के कारण विवो अध्ययन में आवश्यक होता है जो सीएससीएल स्तनधारियों पर डाल सकता है।

Iodixanol का उपयोग rAAV वैक्टर को शुद्ध करने के लिए एक वैकल्पिक आइसो-आसमाटिक ढाल माध्यम के रूप में भी किया गया है, जिसमें सुरक्षा और वेक्टर शक्ति दोनों दृष्टिकोणों से CsCl पर फायदे हैं। हालांकि, सीएससीएल की तरह, आयोडिक्सानोल विधि सेल संस्कृति lysate (और इस प्रकार आरएएवी शुद्धि की मापनीयता) की लोडिंग क्षमता से संबंधित कुछ कमियां प्रस्तुत करता है और यह एक समय लेने वाली और महंगी विधि30,31 बनी हुई है.

इन बाधाओं को दूर करने के लिए, शोधकर्ताओं ने क्रोमैटोग्राफी तकनीकों पर अपना ध्यान केंद्रित किया। इस संबंध में, कई शुद्धिकरण दृष्टिकोण विकसित किए गए थे जो या तो आत्मीयता, हाइड्रोफोबिक या आयन-एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी विधियों को शामिल करते हैं। ये विधियां एक विशेष सीरोटाइप के जैव रासायनिक गुणों पर भरोसा करती हैं, जिसमें उनके प्राकृतिक रिसेप्टर्स, या वायरल कण32 की चार्ज विशेषताएं शामिल हैं। उदाहरण के लिए, खोज है कि AAV2, AAV3, AAV6, और AAV13 अधिमानतः हेपरान सल्फेट प्रोटियोग्लाइकेन्स (HSPG) से बंधते हैं, ने आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी शुद्धि में निकटता से संबंधित हेपरिन का उपयोग करने की संभावना को खोल दिया। हालांकि, एचएसपीजी के लिए बाध्यकारी साइटें सीरोटाइप के बीच भिन्न हो सकती हैं, एएवी लगाव और लक्ष्य कोशिकाओं के संक्रमण को अलग-अलग तरीकों से 2,33,34,35,36 में मध्यस्थता कर सकती हैं। दूसरी ओर, AAV1, AAV5, और AAV6 N-लिंक्ड सियालिक एसिड (SA) से बंधते हैं, जबकि AAV4 O-लिंक्ड SA 2,14,34 का उपयोग करता है। इसी तर्क के बाद, आरएएवी 5 की शुद्धि के लिए एक एकल-चरण आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी प्रोटोकॉल भी म्यूसिन के उपयोग के आधार पर विकसित किया गया है, एक स्तनधारी प्रोटीन जो एसए37 में अत्यधिक समृद्ध है। हेपरिन-आधारित तकनीकों की तरह, यह शुद्धिकरण भी उत्पन्न होने वाले विशिष्ट सीरोटाइप पर निर्भर है। हेपरिन और म्यूसिन के अलावा, ए20 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और कैमलिड सिंगल-डोमेन एंटीबॉडी (एवीबी सेफरोज और पोरोस कैप्चरसेलेक्ट )22,23,38,39,40,41जैसे आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी के लिए अन्य लिगेंड का पता लगाया गया है। पहले से मौजूद शुद्धिकरण विधियों को बेहतर बनाने के लिए अन्य नवीन रणनीतियों में विशिष्ट बाध्यकारी एपिटोप्स पेश करने के लिए आरएएवी कैप्सिड में छोटे संशोधनों की शुरूआत शामिल है। उदाहरण के लिए, हेक्सा-हिस्टिडाइन-टैग या बायोटिनिलेटेड आरएएवी को लिगैंड का उपयोग करके शुद्ध किया जा सकता है जो उन एपिटोप्स (निकल नाइट्रिलोट्रिएसेटिक एसिड और एविडिन रेजिन, क्रमशः)42,43,44को लक्षित करते हैं।

आरएएवी की वांछित विशेषताओं को व्यापक बनाने के प्रयास में, जांचकर्ताओं ने अपने कैप्सिड को मिलाकर विषाणुओं को क्रॉस-ड्रेस किया है। यह उत्पादन के दौरान सममोलर या अलग-अलग अनुपात में दो अलग-अलग एएवी सीरोटाइप से कैप्सिड जीन की आपूर्ति करके पूरा किया जाता है, जिससे विभिन्न सीरोटाइप 34,45,46,47,48,49,50 से कैप्सिड सबयूनिट्स के मिश्रण से बना कैप्सिड संरचना को जन्म मिलता है. पिछले अध्ययन भौतिक साक्ष्य प्रदान करते हैं कि AAV2 से AAV1 (1:1 अनुपात) और AAV2 के साथ AAV9 (1:1 अनुपात) के साथ सह-व्यक्त कैप्सिड प्रोटीन के परिणामस्वरूप क्रमशः मोज़ेक rAAV1/2 और rAAV2/9 वैक्टर की पीढ़ी होती है, क्रमशः 45,46,48। मोज़ेक आरएएवी की पीढ़ी का एक प्रमुख लाभ विभिन्न एएवी सीरोटाइप से लाभप्रद लक्षणों को एकीकृत करने की क्षमता है, जिसके परिणामस्वरूप आरएएवी उत्पादन के दौरान उपयोगी अन्य गुणों को बनाए रखते हुए ट्रांसजीन अभिव्यक्ति और ट्रोपिज्म में सहक्रियात्मक सुधार होता है। दिलचस्प बात यह है कि कुछ मोज़ेक वेरिएंट भी माता-पिता के वायरस 46,47,49से अलग उपन्यास गुण प्रदर्शित करते हैं। AAV2 की हेपरिन-बाइंडिंग क्षमता का लाभ उठाकर, मोज़ेक rAAV वैक्टर संभावित रूप से AAV2 को निर्देशित विकास और/या तर्कसंगत डिज़ाइन द्वारा उत्पन्न अन्य प्राकृतिक या नए AAV कैप्सिड के साथ मिलाकर उत्पन्न और शुद्ध किया जा सकता है। बहरहाल, पिछले अध्ययनों ने मोज़ेक वैक्टर को इकट्ठा करने का प्रयास करते समय कैप्सिड सबयूनिट संगतता के महत्व पर प्रकाश डाला है। उदाहरण के लिए, राबिनोविट्ज़ और सहकर्मियों ने प्रदर्शित किया कि हालांकि AAV1, AAV2, और AAV3 के ट्रांसकैप्सिडेशन ने मोज़ेक कैप्सिड की एक कुशल सह-असेंबली का नेतृत्व किया, AAV4 के साथ इन सीरोटाइप के क्रॉस-ड्रेसिंग ने स्थिर विषाणुओं की पीढ़ी 34,45,47 में बाधा डाली। इसके अतिरिक्त, AAV1, AAV2, और AAV3 ने AAV5 के साथ कम संगतता दिखाई, इन कैप्सिड को अलग-अलग अनुपात में मिलाते समय प्राप्त कम वायरल टाइटर्स को देखते हुए। दिलचस्प बात यह है कि मोज़ेक आरएएवी 2/5 ने हेपरिन-बाध्यकारी गुणों में कमी दिखाई, जबकि माता-पिता के एएवी 5 की तरह म्यूसिन-बाइंडिंग क्षमता को बनाए रखा। हालांकि, 3: 1 अनुपात में आरएएवी 3/5 ने हेपरिन और म्यूसिन के दोहरे बंधन को संरक्षित किया। कुल मिलाकर, बढ़ाया पारगमन, विशिष्ट ट्रोपिज्म, या कम इम्युनोजेनेसिटी के साथ नए मोज़ेक आरएएवी की पीढ़ी कैप्सिड असेंबली और रिसेप्टर इंटरैक्शन की हमारी समझ से बहुत लाभ उठा सकती है, विशिष्ट संयोजनों के साथ अभी भी पूरी तरह से जांच और अनुकूलन की आवश्यकता है।

वर्तमान कार्य में, हम एक अनुकूलित हेपरिन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी विधि का उपयोग करके आरएएवी के उत्पादन और शुद्धिकरण के लिए चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। आरएएवी क्षणिक अभिकर्मक द्वारा निर्मित होते हैं और एक तेज प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (एफपीएलसी) प्रणाली का उपयोग करके शुद्ध होते हैं। चयनित शुद्ध अंशों की एकाग्रता के बाद, परिणामी वायरल स्टॉक को टिटर, शुद्धता, आंतरिक भौतिक गुणों और जैविक गतिविधि के संदर्भ में इन विट्रो और विवो में विशेषता है। अवधारणा के प्रमाण के रूप में, हम मोज़ेक rAAV1/2 और rAAV2/9 वैक्टर की पीढ़ी के लिए इस प्रोटोकॉल के सुधार और प्रयोज्यता का प्रदर्शन करते हैं। प्रत्येक सीरोटाइप की पसंद उनके हड़ताली अलग-अलग ट्रॉपिज्म पर आधारित थी, संभावित रूप से मोज़ेक संस्करणों के लिए भी उनकी अनूठी विशेषताओं को प्रदान करती थी। एएवी सीरोटाइप 1, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के लिए एक समग्र मध्यम ट्रोपिज्म के साथ, न्यूरॉन्स और ग्लिया (कुछ हद तक) को ट्रांसड्यूस करने की क्षमता है और विवो 2,7,8में एंटरोग्रेड और प्रतिगामी दिशाओं में अक्षीय परिवहन से गुजरता है। इसके अतिरिक्त, एएवी सीरोटाइप 9 रक्त मस्तिष्क बाधा पार और नवजात और वयस्क चूहों51,52 दोनों में सीएनएस लक्ष्य करने के लिए अपनी प्राकृतिक क्षमता के लिए चुना गया था. अंत में, एएवी सीरोटाइप 2 को हेपरिन से बांधने की क्षमता दी गई थी, जिससे एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी33 की अनुमति मिली। शुद्ध आरएएवी 1/2 और आरएएवी 2/9 कण माता-पिता एएवी सीरोटाइप दोनों के गुणों को जोड़ते हैं और इसलिए, सीएनएस45,46,48,49के पारगमन के लिए उपयुक्त वैक्टर का गठन करते हैं।

Protocol

नोट: प्रोटोकॉल सारांशित एक उदाहरण के लिए चित्रा 1 देखें. इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, उपकरणों और अभिकर्मकों के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें। कोशिकाओं और वायरस से जुड़े सभी काम समर्पित जैव सुरक्षा अलमारियाँ और इनक्यूबेटरों में किया जाना चाहिए, सेल लाइनों के रखरखाव के लिए नियमित रूप से इस्तेमाल उन लोगों से अलग. सुसंस्कृत कोशिकाओं और वायरस के संपर्क में आने वाले उपकरण और अभिकर्मक बाँझ होने चाहिए। यह आवश्यक है कि वायरस से दूषित खतरनाक अभिकर्मकों और सामग्रियों का निपटान सामग्री सुरक्षा डेटा शीट के अनुसार और प्रत्येक संस्थान के पर्यावरणीय स्वास्थ्य और सुरक्षा कार्यालय द्वारा प्रदान किए गए राष्ट्रीय कानूनों और दिशानिर्देशों के अनुपालन में किया जाता है। अप्रैल 2019 तक, पुनः संयोजक या सिंथेटिक न्यूक्लिक एसिड अणुओं से जुड़े अनुसंधान के लिए एनआईएच दिशानिर्देश जोखिम समूह 1 एजेंटों (स्वस्थ वयस्क मनुष्यों में बीमारी से जुड़े नहीं) सभी एएवी सीरोटाइप, साथ ही पुनः संयोजक या सिंथेटिक एएवी निर्माणों के रूप में वर्गीकृत करते हैं। यह वर्गीकरण तब लागू होता है जब ट्रांसजीन संभावित ट्यूमरजेनिक जीन उत्पाद या विष को एन्कोड नहीं करता है, और निर्माण एक सहायक वायरस के बिना उत्पन्न होते हैं।

जानवरों से जुड़े सभी प्रयोग प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए यूरोपीय संघ समुदाय के निर्देश (2010/63/ईयू) के अनुपालन में किए गए थे, 2013 में पुर्तगाली कानून (डिक्री कानून 113/2013) में स्थानांतरित किए गए थे। इसके अतिरिक्त, पशु प्रक्रियाओं को कोयम्बरा लाइसेंस प्राप्त पशु सुविधा विश्वविद्यालय के चिकित्सा संकाय और तंत्रिका विज्ञान और कोशिका जीवविज्ञान केंद्र के पशु कल्याण के लिए जिम्मेदार संगठन द्वारा अनुमोदित किया गया था। शोधकर्ताओं ने प्रयोगों को करने के लिए पुर्तगाली अधिकारियों (Direcção Geral de Alimentação e Veterinária, Lisbon, पुर्तगाल) से पर्याप्त प्रशिक्षण (FELASA-प्रमाणित पाठ्यक्रम) और प्रमाणन प्राप्त किया।

1. प्लास्मिड निर्माण करता है

  1. निम्नलिखित प्लास्मिड की पर्याप्त डीएनए मात्रा को अलग और शुद्ध करने के लिए मैक्सिप्रेप एंडोटॉक्सिन-मुक्त किट के निर्माता के निर्देशों का पालन करें: i) pITR: ब्याज का स्थानांतरण वेक्टर; ii) pAAV-RC प्लाज्मिड: pRV1, जिसमें AAV2 प्रतिनिधि और कैप अनुक्रम36 होते हैं; iii) pAAV-RC प्लाज्मिड: pH21, जिसमें AAV1 प्रतिनिधि और कैप अनुक्रम36 होते हैं; iv) pAAV-RC प्लाज्मिड: pAAV2/9n, जिसमें AAV2 प्रतिनिधि और AAV9 कैप अनुक्रम होते हैं; v) pहेल्पर: pFdelta6, एडेनोवायरस-हेल्पर प्लास्मिड36.
  2. अनुशंसित एंजाइमी प्रतिबंधों को निष्पादित करके उत्पन्न प्लास्मिड की अखंडता को स्क्रीनकरें 36. SmaI के साथ पाचन द्वारा pITR प्लास्मिड की अखंडता की निगरानी, एक प्रतिबंध endonuclease, जो ITRs53,54 के एक अस्थिर हिस्से के भीतर दो बार कटौती.
    नोट: चूंकि आईटीआर अत्यधिक अस्थिर और विलोपन के लिए अतिसंवेदनशील हैं, इसलिए इन साइटों में पुनर्संयोजन को कम करने के लिए SURE 2 सुपरकंपीटेंट सेल के उपयोग की सिफारिश की जाती है।

2. सेल संस्कृति

  1. संस्कृति मानव भ्रूण गुर्दे 293, स्थिर रूप से Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) उच्च ग्लूकोज में SV40 बड़े टी प्रतिजन (HEK293T) सेल लाइन व्यक्त, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक, 37 डिग्री सेल्सियस पर, 5% सीओ2 युक्त आर्द्र वातावरण के तहत, बाद के चरणों के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में।
  2. 0.05% ट्रिप्सिन-एथिलीनडायमिनेटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) जोड़ने से पहले कोशिकाओं को धोने के लिए बाँझ 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस), पीएच 7.4 का उपयोग करके कोशिकाओं को उपसंस्कृति करें।
    नोट: उन कोशिकाओं का उपयोग करने से बचें जो अत्यधिक संख्या में मार्ग (अधिकतम 20) से गुज़री हैं। माइकोप्लाज्मा संदूषण के लिए नियमित रूप से सेल संस्कृतियों का परीक्षण करें।

3. क्षणिक अभिकर्मक द्वारा आरएएवी उत्पादन

  1. दिन 1: सेल चढ़ाना
    1. प्रत्येक वायरल उत्पादन के लिए, प्लेट HEK293T कोशिकाओं को 10 उपचारित संस्कृति व्यंजन (15 सेमी व्यास) में अभिकर्मक से एक दिन पहले, पूरक संस्कृति माध्यम के 22 एमएल में प्रति डिश 10.5 × 106 कोशिकाओं के घनत्व पर और 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें जब तक कि कोशिकाएं 70% -80% संगम और अभिकर्मक के लिए तैयार न हों।
  2. दिन 2: पॉलीथीनमाइन (पीईआई) का उपयोग करके सेल अभिकर्मक
    1. प्रत्येक वायरल उत्पादन (10.5 व्यंजनों के बराबर) के लिए, एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में निम्नलिखित अभिकर्मक मिश्रण स्थापित करें: 54.6 माइक्रोग्राम पीआईटीआर; पीआरवी 1 का 45.675 माइक्रोग्राम; पीएच 21 या पीएएवी 2/9 एन के 45.675 माइक्रोग्राम; pFdelta6 का 109.2 μg। टैप करके मिलाएं।
    2. 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में गैर-पूरक डीएमईएम के 4.557 एमएल में मिश्रण जोड़ें। टैप करके मिलाएं।
    3. 1 मिलीग्राम/एमएल (पीएच 7.4) पर बाँझ पीईआई समाधान के 1.365 एमएल जोड़ें, ड्रॉप द्वारा ड्रॉप। टैप करके मिलाएं। डीएनए-पीईआई परिसरों के गठन की अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
    4. इस मिश्रण को प्रीवार्म्ड सप्लीमेंटेड डीएमईएम के 231 एमएल में जोड़ें। इस अभिकर्मक मिश्रण के 22 एमएल के साथ प्रत्येक पकवान के पूरे संस्कृति माध्यम बदलें. 48 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
      नोट: सेल टुकड़ी से बचने के लिए इस कदम को देखभाल के साथ किया जाना चाहिए।
  3. दिन 4: सेल फसल
    1. जब pITR एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर को एन्कोड करता है, तो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की कल्पना करें।
    2. प्रत्येक डिश से माध्यम को 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में इकट्ठा करें और उन्हें 10 मिनट के लिए 800 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
      नोट: यह कदम वैकल्पिक है और ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं है कि एक बहुत ही उच्च संगम के कारण अलग हो सकता है को ठीक करने के लिए करना है.
    3. प्रत्येक थाली में पहले से गरम पीबीएस के 10 एमएल जोड़ें. धीरे एक सेल खुरचनी के साथ कोशिकाओं को हटा दें और चरण 3.3.2 से 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में निलंबन इकट्ठा करें।
    4. पीबीएस के अतिरिक्त 10 एमएल के साथ एक समय में 5 व्यंजन धोएं और निलंबन को चरण 3.3.3 से 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में स्थानांतरित करें। 10 मिनट के लिए 800 × ग्राम पर कोशिकाओं को गोली और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    5. -80 डिग्री सेल्सियस पर सेल छर्रों फ्रीज.
      नोट: सेल छर्रों कई महीनों (ठहराव बिंदु) के लिए संग्रहीत किया जा सकता है.

4. आरएएवी निष्कर्षण और एफपीएलसी शुद्धि

  1. दिन 5: सेल lysate तैयारी
    1. कमरे के तापमान पर सेल छर्रों पिघलना. अल्ट्राप्योर (टाइप I) पानी में 150 एमएम सोडियम क्लोराइड (NaCl) और 20 एमएम ट्रिस, पीएच 8.0 युक्त बाँझ बफर के 100 एमएल में 10 व्यंजनों से एकत्र कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। एक सजातीय निलंबन सुनिश्चित करने के लिए, ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा निलंबन मिलाएं।
    2. सेल लसीका को प्रेरित करने के लिए अल्ट्राप्योर पानी में 10% सोडियम डीऑक्सीकोलेट के ताजा तैयार बाँझ समाधान के 12.5 एमएल जोड़ें। ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं।
      नोट: सामग्री सुरक्षा डेटा शीट और संस्था के पर्यावरणीय स्वास्थ्य और सुरक्षा कार्यालय द्वारा प्रदान किए गए दिशानिर्देशों के अनुसार, सोडियम डीऑक्सीकोलेट, साथ ही इसके संपर्क में आने वाली सामग्रियों का निपटान। इस पाउडर को संभालते समय फेस मास्क पहनने की भी सलाह दी जाती है। मिश्रण के बाद, समाधान अत्यधिक चिपचिपा हो जाता है।
    3. पिछले मिश्रण में बेंज़ोनेस न्यूक्लिएज के 27 माइक्रोन जोड़ें। ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह मिलाएं जब तक कि नमूना चिपचिपा न रह जाए। 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, हर 10 मिनट में एक भंवर का प्रदर्शन करते हैं।
      नोट: यह एंडोन्यूक्लिज़ किसी भी प्रोटियोलिटिक गतिविधि का प्रदर्शन किए बिना डीएनए और आरएनए के सभी रूपों को कुशलतापूर्वक अपमानित करने में सक्षम है।
    4. 25 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए 3,000 × ग्राम पर मिश्रण को सेंट्रीफ्यूज करके सेलुलर मलबे को हटा दें। एक 0.45 माइक्रोन बाँझ polyvinylidene difluoride (PVDF) सिरिंज फिल्टर के साथ सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर और यह एक नया बाँझ कंटेनर में हस्तांतरण.
      नोट: यह महत्वपूर्ण कदम सुनिश्चित करता है कि अधिकांश सेलुलर मलबे को हटा दिया जाता है, इसलिए क्रोमैटोग्राफी कॉलम के क्लॉगिंग को रोकता है। विश्लेषण (वैकल्पिक कदम) के लिए इस मिश्रण का एक छोटा सा विभाज्य बचाओ.
  2. दिन 5 (जारी): आरएएवी का हेपरिन कॉलम शुद्धिकरण
    नोट: नमूना आवेदन एक नमूना पंप या सिस्टम के हिस्से के रूप में एक 50 एमएल या 150 एमएल सुपरलूप का उपयोग करके किया जा सकता है। चूंकि कम तापमान पर अधिक हवा घुल जाती है, इसलिए एफपीएलसी प्रणाली में उनके उपयोग से पहले कमरे के तापमान के अनुकूल होने के लिए बफर और समाधान (आमतौर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) के लिए पर्याप्त समय देना महत्वपूर्ण है।
    1. वैकल्पिक: यदि सिस्टम को लंबे समय तक संग्रहीत किया गया है, तो सिस्टम और सभी इनलेट्स को मैन्युअल निर्देशों या पूर्वनिर्धारित सिस्टम क्लीनिंग इन प्लेस (सिस्टम सीआईपी) विधि का उपयोग करके ताजा तैयार भंडारण समाधान (20% इथेनॉल) से भरें।
    2. पूरी तरह से मैनुअल निर्देशों या एक पूर्वनिर्धारित प्रणाली सीआईपी विधि का उपयोग कर बाँझ ultrapure पानी के साथ तरल प्रवाह पथ धो लें.
    3. एक 1 एमएल प्रीपैक्ड हेपरिन कॉलम कनेक्ट करें, दबाव अलार्म सेट करें, और 1 एमएल / मिनट की प्रवाह दर पर अल्ट्राप्योर पानी के पांच कॉलम वॉल्यूम (सीवी) के साथ धो लें।
    4. इनलेट ए (सिस्टम पंप ए) के लिए बफर ए (अल्ट्राप्योर पानी में 100 एमएम एनएसीएल और 20 एमएम ट्रिस, पीएच 8 का बाँझ समाधान) और इनलेट बी (सिस्टम पंप बी) के लिए बफर बी (500 एमएम एनएसीएल और 20 एमएम ट्रिस, पीएच 8 के बाँझ समाधान) के लिए बफर पानी से बफर ट्रे में समाधान स्विच करें। यदि सिस्टम में एक नमूना पंप है, तो बफर ए में नमूना इनलेट वाल्व के बफर इनलेट को रखें।
    5. बफर बी के साथ सिस्टम पंप बी धो लें और बफर ए के साथ तरल प्रवाह पथ के बाकी भरें.
      नोट: यदि आवश्यक हो, तो प्रवाह पथ से कॉलम को डिस्कनेक्ट करें और बाद में इसे फिर से कनेक्ट करें।
    6. नमूना इनलेट वाल्व से एक नमूना इनलेट टयूबिंग डालें, उदाहरण के लिए, एस 1, चरण 4.1.4 में प्राप्त वायरल तैयारी के साथ कंटेनर में। (सेल लाइसेट तैयारी से)। नमूना समाधान के साथ इंजेक्शन वाल्व के लिए नमूना इनलेट एस 1 से प्रवाह पथ प्रधान। वैकल्पिक रूप से, एक 50 एमएल सिरिंज का उपयोग कर rAAVs युक्त नमूना के साथ एक 50 एमएल या 150 एमएल superloop भरें.
    7. 1 एमएल/मिनट की दर से बफर बी के 12.5% का उपयोग करके पांच सीवी की कुल मात्रा के साथ कॉलम को संतुलित करें।
    8. नमूना पंप ( एयर सेंसर का उपयोग करके सभी नमूना इंजेक्ट करने का चयन करें) या 0.5 एमएल/मिनट पर सुपरलूप का उपयोग करके कॉलम में नमूना की कुल मात्रा लागू करें और एक नए बाँझ कंटेनर में आउटलेट पोर्ट का उपयोग करके फ्लोथ्रू एकत्र करें।
      नोट: जब ओवरप्रेशर सुविधा को रोकने के लिए प्रवाह नियंत्रण सक्षम होता है, तो कॉलम क्लॉगिंग के मामले में प्रवाह स्वचालित रूप से कम हो जाएगा। यदि प्रवाह दर 0.5 एमएल/मिनट से काफी कम हो जाती है, नमूना आवेदन को रोकें, बफर ए के 2-5 सीवी के साथ धोएं, और फिर नमूना आवेदन फिर से शुरू करें।
    9. बफर ए के 20 सीवी के साथ 1 एमएल / मिनट पर कॉलम धोएं, आउटलेट पोर्ट का उपयोग करके फ्लोथ्रू इकट्ठा करें।
    10. निम्नलिखित योजना के साथ 1 एमएल / मिनट पर नमूना एल्यूट करें: i) पांच सीवी के लिए बफर बी के 50% के लक्ष्य के साथ रैखिक ढाल; ii) पांच सीवी के दौरान बफर बी के 90% के लक्ष्य के साथ कदम; (iii) पांच सीवी के दौरान बफर बी के 100% के लक्ष्य के साथ कदम।
    11. एक अंश कलेक्टर और कम प्रतिधारण माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों (2 एमएल) का उपयोग करके 1 एमएल अंशों में एल्यूटेड नमूना एकत्र करें और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: आरएएवी अंशों को कई हफ्तों (ठहराव बिंदु) के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।
    12. पांच सीवी के लिए बफर बी के 12.5% के साथ 1 एमएल / मिनट पर कॉलम को फिर से संतुलित करें।
    13. बफर समाधान से इनलेट्स को अल्ट्राप्योर पानी में स्विच करें और कॉलम को पांच सीवी के लिए 1 एमएल/मिनट पर धोएं।
    14. अल्ट्राप्योर पानी से इनलेट्स को 20% इथेनॉल पर स्विच करें और कॉलम को पांच सीवी के लिए 1 एमएल/मिनट पर धोएं। कॉलम को डिस्कनेक्ट करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: कॉलम को किसी भी अन्य प्रमुख सफाई और स्वच्छता प्रक्रियाओं के बिना कई बार पुन: उपयोग किया जा सकता है यदि एक ही आरएएवी सीरोटाइप और ट्रांसजीन का उपयोग किया जाता है।
    15. पूरी तरह से मैनुअल निर्देश या एक पूर्वनिर्धारित प्रणाली सीआईपी विधि का उपयोग कर 20% इथेनॉल के साथ तरल प्रवाह पथ धो लें.

5. शुद्ध आरएएवी की एकाग्रता

  1. दिन 6: एकाग्रता चरण 1
    1. एक 100 केडीए आणविक वजन कटऑफ के साथ एक 15 एमएल केन्द्रापसारक फिल्टर इकाई का उपयोग कर rAAVs ध्यान लगाओ. 15 एमएल केन्द्रापसारक फिल्टर इकाई में आरएएवी (एफपीएलसी अंश 7 से 16) युक्त वांछित अंशों को लोड करें और इसे कमरे के तापमान पर 2 मिन के लिए 2,000 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें। सुनिश्चित करें कि फिल्टर यूनिट में केंद्रित मात्रा लगभग 500 माइक्रोन है। यदि केंद्रित मात्रा काफी हद तक 500 माइक्रोन से अधिक है, तो 1 मिनट के अंतराल में सेंट्रीफ्यूजेशन चरणों को दोहराएं जब तक कि यह वांछित मात्रा तक न पहुंच जाए।
  2. दिन 6 (जारी): बफर एक्सचेंज
    1. आरएएवी युक्त केन्द्रापसारक फिल्टर इकाई में बाँझ पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें। फिल्टर को धोने के लिए सावधानी से ऊपर और नीचे पिपेट करें। 500 माइक्रोन की अंतिम मात्रा तक पहुंचने तक 1 मिनट के अंतराल में 2,000 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
  3. दिन 6 (जारी): एकाग्रता चरण 2
    1. पिछले चरण में प्राप्त केंद्रित आरएएवी के 500 माइक्रोन को 100 केडीए आणविक भार कटऑफ और 1 मिनट के लिए 6,000 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र के साथ 0.5 एमएल केन्द्रापसारक फिल्टर इकाई में स्थानांतरित करें। यदि आवश्यक हो, तो सेंट्रीफ्यूजेशन चरण को तब तक दोहराएं जब तक कि 100 माइक्रोन से कम की अंतिम मात्रा तक नहीं पहुंच जाती।
  4. दिन 6 (जारी): वसूली
    1. केंद्रित आरएएवी को पुनर्प्राप्त करने के लिए, फिल्टर डिवाइस को एक नए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज संग्रह ट्यूब में उल्टा रखें। ट्यूब को केंद्र की ओर टोपी के साथ एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में रखें और डिवाइस से माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में केंद्रित आरएएवी स्थानांतरित करने के लिए प्रवाह कक्ष के अंदर लंबे समय तक स्पिन करें। वैकल्पिक रूप से, 2 मिनट के लिए 1,000 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    2. बाँझ Pluronic F-68 0.001% (वैकल्पिक) के साथ पूरक।
      नोट: प्लूरोनिक एफ -68 खाद्य एवं औषधि प्रशासन द्वारा मानव उपयोग के लिए अनुमोदित एक गैर-आयनिक सर्फेक्टेंट है जो कमजोर पड़ने की तैयारी, सिरिंज लोडिंग और वितरण उपकरण 55,56के दौरान उपयोग की जाने वाली सामग्री (प्लास्टिक) की सतहों के साथ उनकी बातचीत को रोककर आरएएवी के नुकसान को कम करने में सक्षम है।
    3. कम प्रतिधारण microcentrifuge ट्यूबों में विभाज्य rAAVs और -80 डिग्री सेल्सियस (ठहराव बिंदु) पर दुकान.

6. शुद्ध आरएएवी की मात्रा का ठहराव

  1. दिन 6 (जारी): वायरल जीनोम/μL (vg/μL) में व्यक्त rAAV तैयारी के अनुमापांक का निर्धारण करें, वास्तविक समय मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (RT-qPCR) द्वारा एक वाणिज्यिक किट का उपयोग करके और निर्माता के निर्देशों का पालन करना।
    1. 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर डीनेस आई के साथ आरएएवी कण समाधान को इनक्यूबेट करें।
      नोट: यह प्रक्रिया मेजबान कोशिकाओं से प्राप्त मुक्त जीनोमिक डीएनए और प्लास्मिड डीएनए के पाचन को बढ़ावा देती है, इस प्रकार यह सुनिश्चित करती है कि बरकरार आरएएवी कणों के अंदर केवल न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम संरक्षित है।
    2. हीट-निष्क्रिय DNase I 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर।
    3. लाइसिस बफर जोड़ें और आरएएवी कणों के प्रोटीन की गर्मी-विकृतीकरण को बढ़ावा देने के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. आरटी-क्यूपीसीआर पर आगे बढ़ने से पहले कमजोर पड़ने वाले बफर में प्राप्त आरएएवी जीनोम समाधान को पतला करें। किट के साथ प्रदान किए गए सकारात्मक नियंत्रण (2 × 107 वीजी /माइक्रोन से 2 × 102 वीजी/माइक्रोन तक) के क्रमिक रूप से पतला मानकों का एक सेट तैयार करें।
    5. Taq II मिश्रण के 12.5 μL, पतला प्राइमर मिश्रण के 0.5 μL, पानी के 7 μL, और पतला rAAV डीएनए के 5 μL (अज्ञात AAV नमूना और चरण 6.1.4 से मानकों) युक्त प्रतिक्रिया मिश्रण करें।
    6. निम्नलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करके वास्तविक समय पीसीआर डिटेक्शन सिस्टम में आरटी-क्यूपीसीआर करें: 2 मिनट (प्रारंभिक विकृतीकरण) के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 1 चक्र और 5 एस (विकृतीकरण) के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 40 चक्र और 30 एस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस (एनीलिंग, एक्सटेंशन, और प्लेट रीडिंग), इसके बाद एक पिघल वक्र विश्लेषण।
    7. मानक वक्र (रैखिक प्रतिगमन रेखा) से पूर्ण नमूना एकाग्रता की गणना, कमजोर पड़ने वाले कारक पर विचार करें जो आरएएवी नमूना तैयार करने के परिणामस्वरूप होता है।
      नोट: वायरल जीनोम की संख्या की मात्रा का ठहराव एएवी 2 (किट द्वारा प्रदान प्राइमरों के लक्ष्य अनुक्रम) के आईटीआर अनुक्रम के प्रवर्धन के माध्यम से प्राप्त किया जाता है।

7. एसडीएस-पेज, कूमासी ब्लू स्टेनिंग, और वेस्टर्न ब्लॉट

  1. प्रत्येक नमूने के 40 माइक्रोन (प्रत्येक एफपीएलसी अंश; प्रवाह; प्रीकॉलम नमूने, और अंतिम केंद्रित उत्पाद के कुल 2.3 × 1010 वीजी) 6x नमूना बफर (0.5 एम ट्रिस-एचसीएल / 0.4% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) पीएच 6.8, 30% ग्लिसरॉल, 10% एसडीएस, 0.6 एम डाइथियोथ्रेइटोल (डीटीटी), 0.012% ब्रोमोफेनॉल नीला) जोड़कर और 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए नमूने इनक्यूबेट करना।
  2. एक एसडीएस-पॉलीक्रिलामाइड जेल (4% स्टैकिंग और 10% समाधान जेल) में विकृत नमूनों (48 माइक्रोन) को लोड करें और प्रोटीन सीढ़ी से सटे 70 मिनट के लिए 100 वी पर इलेक्ट्रोफोरेटिक पृथक्करण करें।
  3. प्रोटीन विश्लेषण
    नोट: या तो Coomassie नीले धुंधला या पश्चिमी सोख्ता प्रदर्शन किया जा सकता है.
    1. Coomassie नीला धुंधला हो जाना
      1. प्रोटीन बैंड कल्पना करने के लिए, एक 0.25% Coomassie नीले G250 समाधान 50% मेथनॉल और 10% एसिटिक एसिड हिमनद में भंग के साथ 10 मिनट के लिए जेल दाग.
      2. कम पृष्ठभूमि के साथ स्पष्ट बैंड दिखाई देने तक 25% मेथनॉल और 5% एसिटिक एसिड ग्लेशियल युक्त समाधान के साथ इसे कई बार धोने से जेल डिस्टेनिंग करें।
      3. एक उपयुक्त इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके छवियों को कैप्चर करें।
    2. वेस्टर्न ब्लॉट
      1. मानक प्रोटोकॉल के अनुसार एक PVDF झिल्ली पर प्रोटीन स्थानांतरण.
      2. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए टीबीएस-टी (ट्रिस-बफर खारा में 0.1% ट्वीन 20) में पतला 5% गैर-वसा वाले दूध में इनक्यूबेशन द्वारा झिल्ली को अवरुद्ध करें।
      3. 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात इनक्यूबेशन के लिए निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी (अवरुद्ध समाधान में पतला) का उपयोग करें: माउस मोनोक्लोनल एंटी-एएवी, वीपी 1, वीपी 2, वीपी 3 एंटीबॉडी (बी 1, 1: 1,000), या माउस मोनोक्लोनल एंटी-एएवी, वीपी 1, वीपी 2 एंटीबॉडी (ए 69, 1: 1,000)।
      4. टीबीएस-टी में 3 x 15 मिनट के लिए झिल्ली धो लें और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए एक क्षारीय फॉस्फेट से जुड़े बकरी विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी (1: 10,000) के साथ सेते हैं।
      5. टीबीएस-टी में 3 एक्स 15 मिनट के लिए झिल्ली धो लें। बढ़ाया chemifluorescent सब्सट्रेट (ECF) जोड़ें और chemifluorescence इमेजिंग द्वारा प्रोटीन बैंड कल्पना.

8. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम)

  1. एक फॉर्मवार-कार्बन-लेपित 200 जाल ग्रिड को एक आरएएवी नमूने की एक बूंद के ऊपर उल्टा रखें और इसे 1 मिनट के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें।
  2. ग्रिड को पानी की एक बूंद में धोएं और फिल्टर पेपर के साथ तरल अतिरिक्त सूखें।
  3. वायरल कणों को ठीक करने और इसके विपरीत करने के लिए 1 मिनट के लिए 1% यूरेनिल एसीटेट समाधान (पीएच 7) के साथ ग्रिड को नकारात्मक रूप से दाग दें।
  4. ग्रिड को पानी की एक बूंद में धोएं और फिल्टर पेपर के साथ तरल अतिरिक्त सूखें।
  5. एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में नमूनों की जांच करें।
    नोट: उच्च नमक सांद्रता सीधे ग्रिड के लिए rAAV के बंधन को प्रभावित कर सकती है और क्रिस्टल जैसी संरचनाओं के दृश्य को जन्म दे सकती है।

9. लगातार पराबैंगनी-दृश्यमान प्रकाश अवशोषण, स्थिर प्रकाश प्रकीर्णन, और गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन विश्लेषण

  1. एक 96 अच्छी तरह से मात्रा का ठहराव प्लेट पर, एक आरएएवी नमूना के 2 माइक्रोन और पीबीएस के 2 माइक्रोन लोड बफर रिक्त के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए (डुप्लिकेट में यह प्रदर्शन).
  2. क्लाइंट विश्लेषण सॉफ्टवेयर में एएवी क्वांट एप्लिकेशन का उपयोग करें, नमूनों के नाम प्लेट के सही स्थान पर रखें, एएवी सीरोटाइप का चयन करें, और अगला क्लिक करें।
  3. समर्पित उपकरणों में 96 अच्छी तरह से मात्रा का ठहराव प्लेट लोड और डेटा अधिग्रहण के लिए थाली पढ़ने के साथ आगे बढ़ना.

10. इन विट्रो ट्रांसडक्शन परख में

  1. आरएएवी की पारगमन दक्षता का त्वरित विश्लेषण करने के लिए विभिन्न सेल लाइनों का उपयोग किया जा सकता है।
    1. 24-अच्छी तरह से प्लेटों में समान रूप से बीज HEK293T कोशिकाएं (137,500 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) और एक माउस न्यूरोब्लास्टोमा -2 ए (न्यूरो 2 ए) सेल लाइन या तो 24-अच्छी प्लेटों (50,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) या 8-अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड (27,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) में, डीएमईएम उच्च ग्लूकोज का उपयोग करके, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक, जैसा कि ऊपर वर्णित है। कोशिकाओं को 5% सीओ2 युक्त आर्द्र वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर पालन करने की अनुमति दें।
    2. प्रत्येक अच्छी तरह से (24 अच्छी तरह से प्लेटों से 250 माइक्रोन और 8 अच्छी तरह से चैम्बर स्लाइड से 50 माइक्रोन) से वातानुकूलित माध्यम लीजिए और बाद में उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इसे स्टोर करें।
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए निम्नलिखित आरएएवी तैयारी जोड़ें और एक 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए कोशिकाओं सेते हैं.
      1. FPLC-एकत्रित अंशों F2-F16 के 50 माइक्रोन जोड़ें और 24-अच्छी प्लेटों में चढ़ाया HEK293T कोशिकाओं के लिए प्रवाह।
      2. 24-अच्छी प्लेटों में चढ़ाया गया न्यूरो2ए कोशिकाओं में पीबीएस के 50 माइक्रोन में पतला केंद्रित आरएएवी के कुल 5.5 × 109 वीजी जोड़ें (कोशिकाओं में पीबीएस के 50 माइक्रोन जोड़कर एक नकारात्मक नियंत्रण अच्छी तरह से शामिल करें)।
      3. 8-अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड में चढ़ाया गया न्यूरो 2 ए कोशिकाओं के लिए पीबीएस के 25 माइक्रोन में पतला केंद्रित आरएएवी के कुल 2.75 × 109 वीजी जोड़ें (कोशिकाओं को पीबीएस के 50 माइक्रोन जोड़कर नकारात्मक नियंत्रण स्थिति शामिल करें)।
    4. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए पहले से संग्रहीत वातानुकूलित माध्यम (चरण 10.1.2) जोड़ें और 24 घंटे के लिए सेते हैं.
    5. माध्यम त्यागें और पीबीएस के साथ कोशिकाओं 2x धो लें.
    6. एक 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) समाधान जोड़ें, पीबीएस में 4% सुक्रोज के साथ पूरक, 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रीवार्म, प्रत्येक अच्छी तरह से और 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    7. पीबीएस के साथ 2x धोएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि इमेजिंग (ठहराव बिंदु) नहीं किया जाता है।
    8. एक 10x/0.30 उद्देश्य के साथ सुसज्जित एक उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप, या एक 40x/1.4 तेल डीआईसी उद्देश्य के साथ सुसज्जित एक उल्टे confocal माइक्रोस्कोप पर छवियों को प्राप्त करें.
  2. विवो वातावरण में अधिक प्रासंगिक और चिंतनशील मॉडल रखने के लिए, प्राथमिक न्यूरोनल संस्कृतियों का उपयोग निम्नानुसार करें:
    1. कॉर्टिकल न्यूरॉन्स की प्राथमिक संस्कृतियों को तैयार करें जैसा कि पहले सैंटोस एट अल द्वारा वर्णित है।57. संक्षेप में, 12-अच्छी प्लेटों में 200,000 कोशिकाओं/एमएल बीज और इन विट्रो 16 में दिन तक उन्हें संस्कृति में बनाए रखें।
    2. प्रत्येक अच्छी तरह से (100 माइक्रोन) से वातानुकूलित माध्यम लीजिए और बाद में उपयोग के लिए इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से परीक्षण किए जाने वाले आरएएवी जोड़ें: पीबीएस के 25 माइक्रोन में पतला केंद्रित आरएएवी के कुल 2.75 × 109 वीजी (नकारात्मक नियंत्रण शामिल करें: पीबीएस के 25 माइक्रोन)। 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. पहले से संग्रहीत वातानुकूलित माध्यम जोड़ें और 24 घंटे के लिए सेते हैं।
    5. प्रत्येक अच्छी तरह से में माध्यम त्यागें और पीबीएस के साथ 2x धो लें.
    6. पीबीएस में 4% पीएफए/4% सुक्रोज के साथ कोशिकाओं को ठीक करें, जैसा कि चरण 10.1.6 में वर्णित है। पीबीएस के साथ 2x धो लें।
    7. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए एलेक्सा फ्लोर 633 के साथ संयुग्मित गेहूं रोगाणु एग्लूटीनिन (डब्ल्यूजीए) के 5 माइक्रोग्राम/एमएल के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से इनक्यूबेट करें (वैकल्पिक कदम: इसके बजाय इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री करें)। पीबीएस के साथ 2x धो लें।
    8. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए पीबीएस में 0.25% ट्राइटन एक्स-100 में सेते हैं। पीबीएस के साथ धो लें।
    9. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) के साथ सेते हैं. पीबीएस के साथ 2x धो लें।
    10. एक 40x/0.95 उद्देश्य से लैस एक उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर छवियों को प्राप्त करें, या एक 40x/1.4 तेल डीआईसी उद्देश्य से लैस एक उल्टे कन्फोकल माइक्रोस्कोप.

11. विवो प्रयोगों में

नोट: जानवरों को एक तापमान नियंत्रित कमरे में रखा गया था, जो 12 घंटे प्रकाश/अंधेरे चक्र पर बनाए रखा गया था। भोजन और पानी को एड लिबिटम प्रदान किया गया था। जानवरों की पीड़ा को कम करने के लिए सभी प्रयास किए गए थे।

  1. सेरिबैलम में स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन
    1. वेपोराइज़र से जुड़े कक्ष में ऑक्सीजन (0.8 L/min) की उपस्थिति में 2% isoflurane के साँस द्वारा 9-सप्ताह पुराने C57BL/6 जानवरों को एनेस्थेटाइज करें।
    2. एनेस्थेटाइज्ड जानवर को स्टीरियोटैक्सिक उपकरण (35 डिग्री सेल्सियस गर्म पैड पर) में रखें और आइसोफ्लुरेन मास्क को जानवर की नाक में रखें। आइसोफ्लुरेन स्तर को 1.3-1.7% तक कम करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि आगे बढ़ने से पहले जानवर सही ढंग से संवेदनाहारी है (दोनों हिंद अंगों में लचीलापन के लिए पलटा का नुकसान)।
    3. कॉर्निया के सूखने से बचने के लिए स्नेहक आंख मरहम लागू करें और एक अनुमोदित एनाल्जेसिक के साथ जानवर को इंजेक्ट करें।
      नोट: बाद के सभी चरणों को बाँझ स्थितियों में किया जाना चाहिए।
    4. जानवर के सिर के फर शेविंग और शल्य चिकित्सा क्षेत्र कीटाणुरहित करने के बाद, खोपड़ी का पर्दाफाश और एक 30 जी कुंद टिप इंजेक्शन सुई की नोक जगह, एक 10 माइक्रोन हैमिल्टन सिरिंज से जुड़े, सीधे bregma पर (stereotaxic निर्देशांक की गणना के लिए शून्य के रूप में bregma का उपयोग करें).
    5. इरादा समन्वय करने के लिए सुई ले जाएँ और खोपड़ी जहां सुई में प्रवेश करेंगे के माध्यम से एक छेद ड्रिल.
      नोट: इस अध्ययन के ढांचे में, सेरिबैलम में एक एकल इंजेक्शन केंद्रीय रूप से किया गया था।
    6. आरएएवी के समाधान के 4 माइक्रोन को इंजेक्ट करें जिसमें कुल 8 × 109 वीजी होता है, जो पीबीएस में पतला होता है, एक स्वचालित इंजेक्टर का उपयोग करके 0.5 माइक्रोन/मिनट की जलसेक दर पर। एक वयस्क C57BL/6 माउस के सेरिबैलम में केंद्रीय रूप से एक इंजेक्शन करने के लिए, ब्रेग्मा से गणना की गई निम्नलिखित निर्देशांक का उपयोग करें: एंटीरो-पोस्टीरियर: -6.5 मिमी; पार्श्व: 0 मिमी; उदर: -2.9 मिमी।
      नोट: ये निर्देशांक माउस तनाव, लिंग, और उपयोग में जानवरों की उम्र के अनुसार भिन्न हो सकते हैं.
    7. बैकफ्लो को कम करने और वायरल वेक्टर प्रसार की अनुमति देने के लिए, एक बार जलसेक पूरा हो जाने के बाद, 3 मिन के लिए इन निर्देशांक पर सिरिंज सुई छोड़ दें, फिर धीरे-धीरे इसे 0.3 मिमी तक वापस ले लें, और इसे माउस मस्तिष्क से पूरी तरह से हटाने से पहले 2 अतिरिक्त मिनट के लिए जगह में रहने दें।
    8. चीरा बंद करें और इसे कीटाणुनाशक एजेंट (जैसे, 10% पोविडोन-आयोडीन) से साफ करें।
    9. जानवरों को अपने घर पिंजरों में लौटने से पहले संज्ञाहरण से उबरने की अनुमति दें।
  2. ऊतक संग्रह और तैयारी
    नोट: इस प्रयोग में, इंजेक्शन के 12 सप्ताह बाद पारगमन का स्तर देखा गया था, लेकिन इंजेक्शन के बाद 4 सप्ताह के रूप में जल्द ही एक ही प्रक्रिया का मूल्यांकन किया जा सकता है।
    1. xylazine/ketamine (8/160 mg/kg शरीर के वजन) की अधिक मात्रा के इंट्रापेरिटोनियल प्रशासन द्वारा जानवरों को गंभीर रूप से एनेस्थेटाइज करें।
    2. Transcardially 2.5 एमएल / मिनट की दर से 6 मिनट के लिए बर्फ ठंड पीबीएस के साथ जानवरों perfuse, एक ही दर पर 10 मिनट के लिए एक ताजा तैयार बर्फ ठंड 4% पीएफए समाधान के साथ छिड़काव के बाद.
    3. कमरे के तापमान पर रात भर 4% पीएफए में उत्तेजित दिमाग को पोस्टफिक्स करें और फिर उन्हें क्रायोप्रोटेक्शन के लिए 25% सुक्रोज / पीबीएस समाधान में स्थानांतरित करें। एक बार दिमाग डूब (लगभग 48 घंटे बाद में), उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    4. -21 डिग्री सेल्सियस पर क्रायोस्टेट का उपयोग करके 30 माइक्रोन की मोटाई के साथ धारावाहिक धनु वर्गों को काटें। प्रत्येक जानवर के लिए, पीबीएस में मुक्त अस्थायी वर्गों 0.05% सोडियम एजाइड के साथ पूरक के रूप में शारीरिक श्रृंखला में एक मस्तिष्क गोलार्द्ध के 96 धनु वर्गों इकट्ठा. आगे की प्रक्रिया तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. मानक प्रतिदीप्ति इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री
    1. एक दूसरे से 240 माइक्रोन की दूरी पर, जानवर प्रति आठ धनु वर्गों का चयन करें.
    2. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए अवरुद्ध/पारगम्यता समाधान (पीबीएस में 10% सामान्य बकरी सीरम (एनजीएस) युक्त 0.1% ट्राइटन एक्स -100) में मुक्त अस्थायी वर्गों को इनक्यूबेट करें।
    3. चिकन पॉलीक्लोनल एंटी-जीएफपी प्राथमिक एंटीबॉडी (1: 1,000) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर वर्गों को इनक्यूबेट करें।
    4. पीबीएस में 3 x 15 मिनट के लिए धो लें और एलेक्सा फ्लोर 488 फ्लोरोफोर (1:200) के लिए संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी बकरी पॉलीक्लोनल एंटी-चिकन एंटीबॉडी के साथ कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए वर्गों को इनक्यूबेट करें।
    5. पीबीएस में 3 x 15 मिनट के लिए धो लें. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए डीएपीआई के साथ सेते हैं।
    6. पीबीएस में 3 x 15 मिनट के लिए धो लें. जिलेटिन-लेपित स्लाइड में वर्गों को रखें और प्रतिदीप्ति बढ़ते माध्यम के साथ कवरस्लिप करें।
    7. एक स्लाइड स्कैनर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप एक 20x/0.8 उद्देश्य के साथ सुसज्जित पर छवियों को प्राप्त करें.

Representative Results

इस काम में, हम मोज़ेक आरएएवी ( चित्रा 1 में संक्षेपित) के उत्पादन, शुद्धिकरण और लक्षण वर्णन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जिसमें सीएनएस (जैसे एएवी 1 और एएवी 9) को लक्षित करने और प्रसारित करने की क्षमता है, एक साथ हेपरिन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी शुद्धि (एएवी 2) के लिए उपयुक्त है। इसे प्राप्त करने के लिए, प्राकृतिक एएवी सीरोटाइप 1, 2, और 9 से कैप्सिड का उपयोग मोज़ेक आरएएवी 1/2 और आरएएवी 2/9 वैक्टर विकसित करने के लिए किया गया था।

शुरू करने से पहले, संरचनात्मक अखंडता के लिए प्लास्मिड तैयारी की जांच की गई। क्लोनिंग टुकड़ों के सही सम्मिलन को मान्य करने के लिए आवश्यक पाचन के अलावा, संभावित आईटीआर विलोपन/सम्मिलन का पता लगाने के लिए लगातार पीटीआर प्लास्मिड को स्क्रीन करना आवश्यक है। एक उदाहरण के रूप में, एक pITR प्लाज्मिड के विभिन्न क्लोन में आईटीआर की अखंडता प्रतिबंध एंजाइम SmaI (अनुपूरक चित्रा एस 1) के साथ प्लाज्मिड पाचन के बाद नजर रखी गई थी.

दोनों प्रकार के मोज़ेक वैक्टर मानक अभिकर्मकविधियों 6 के अनुसार, 1: 1 अनुपात में संबंधित एएवी कैप्सिड प्लास्मिड के सह-अभिकर्मक द्वारा उत्पन्न किए गए थे। संक्षेप में, HEK293T कोशिकाओं को i) एक प्लाज्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था जिसमें ITR (pITR) अनुक्रमों के बीच पैक की गई ब्याज की ट्रांसजीन होती है, ii) एक प्लास्मिड जिसमें जंगली प्रकार AAV जीनोम प्रतिनिधि और AAV2 और AAV1 या AAV9 (pAAV-RC प्लास्मिड) और iii) एडेनोवायरल प्रोटीन (E1A, E1B, E4, और E2A) के साथ-साथ सहायक कार्यों (pHelper) के लिए आवश्यक एडेनोवायरस वायरस से जुड़े RNAs को संहिताबद्ध करने वाला प्लाज्मिड। अड़तालीस घंटे बाद, कोशिकाओं को 6,36 काटा गया, और आरएएवी को एफपीएलसी प्रणाली का उपयोग करके एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी द्वारा सेल होमोजेनेट से शुद्ध किया गया। जैसा कि चित्र 2 ए में दर्शाया गया है, कॉलम संतुलन (संतुलन चरण) के बाद, आरएएवी युक्त सेल लाइसेट को कॉलम (नमूना लोडिंग) पर लागू किया गया था। हेपरिन33 के लिए आरएएवी 2 की प्राकृतिक आत्मीयता के कारण, आरएएवी कॉलम के राल से बंधे हैं, जबकि अन्य घटकों को रनिंग बफर में किया गया था और यूवी मॉनिटर (फ्लोथ्रू) द्वारा पता लगाया गया था, जिसके परिणामस्वरूप अवशोषण में वृद्धि हुई थी। स्तंभ बाद में धोया गया था (कदम धोने) और rAAVs अंत में NaCl एकाग्रता (क्षालन कदम) की वृद्धि से eluted थे. यूवी मॉनिटर द्वारा एल्यूटेड वायरस का पता लगाया गया और 1 एमएल अंशों में एकत्र किया गया।

आरएएवी 1/2 और आरएएवी 2/9 का एक प्रतिनिधि क्षालन शिखर प्रोफ़ाइल क्रमशः चित्रा 2 बी और पूरक चित्रा एस 2 ए में दिखाया गया है, जिसमें विभिन्न वायरल बैच लगातार एफ 7 से एफ 16 तक अंश एफ 7 से शुरू होने वाली एकल चोटी पेश करते हैं। पीक ऊंचाई आरएएवी प्रस्तुतियों के बीच परिवर्तनशील है, उच्च चोटियों के साथ आमतौर पर उच्च आरएएवी पैदावार होती है। उत्पादित आरएएवी 1/2 और आरएएवी 2/9 के प्रत्येक अंश को बाद में वायरल टाइटर्स(चित्रा 2सी और पूरक चित्रा एस2बी)का आकलन करने के लिए आरटी-क्यूपीसीआर द्वारा विशेषता दी गई थी।

एल्यूटेड सामग्री की शुद्धता को चिह्नित करने के लिए, प्रत्येक अंश के 40 माइक्रोन और संबंधित प्रवाह की जांच 10% एसडीएस-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (आरएएवी 1/2 के लिए चित्रा 2 डी और आरएएवी 2/9 के लिए पूरक चित्रा एस 2 सी ) द्वारा की गई थी। Coomassie नीले धुंधला अंश F7-F16 में तीन प्रमुख बैंड का पता चला, VP1 (87 kDa), VP2 (72 kDa), और VP3 (62 kDa) उचित अनुपात 1:1:10 पर AAV के capsid प्रोटीन के अनुरूप आणविक भार के साथ, जैसा कि पहले वान Vliet और सहयोगियों14 द्वारा वर्णित है. दोनों ही मामलों में, और यूवी अवशोषण, आरटी-क्यूपीसीआर, और जेल बैंड तीव्रता के आधार पर, यह स्पष्ट है कि अधिकांश मोज़ेक आरएएवी अंशों एफ 7 और एफ 8 में मौजूद हैं और अंशों एफ 9-एफ 16 में धीरे-धीरे कम होने लगते हैं। तीन वायरल कैप्सिड प्रोटीन के अलावा, आकार में लगभग 17 केडीए का एक और प्रोटीन (या प्रोटीन) अंशों एफ 8-एफ 16 में पाया गया था।

इस सह-शुद्ध प्रोटीन (ओं) को खत्म करने के लिए, अंशों F7-16 को बाद में फ़िल्टर किया गया और 100 KDa केन्द्रापसारक फिल्टर इकाइयों का उपयोग करके केंद्रित किया गया और अंतिम rAAV टिटर RT-qPCR द्वारा निर्धारित किया गया था (जैसा कि चित्र 3A, B में दिखाया गया है। आरएएवी उत्पादन की अंतिम उपज पीटीआर की लंबाई और जटिलता, आईटीआर अनुक्रमों की अखंडता, सेल संस्कृति की स्थिति (जैसे, सेल मार्ग की संख्या), और अभिकर्मक दक्षता 24,58,59,60,61पर निर्भर है। बहरहाल, अंतिम अनुमापांक 0.5 एमएल केन्द्रापसारक फिल्टर इकाइयों (एकाग्रता चरण 2) का उपयोग कर आरएएवी तैयारी के कई centrifugations प्रदर्शन करके समायोजित किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल के बाद, 50 से 100 माइक्रोन की सीमा में अंतिम मात्रा के लिए, सांद्रता आमतौर पर 2 × 109 और 5 × 1010 वीजी / μL (संदर्भित अनुमापन किट का उपयोग करके की गई मात्रा) के बीच शामिल होती है।

अंतिम आरएएवी प्रीप्स की शुद्धता का मूल्यांकन 10% एसडीएस-पॉलीक्रिलामाइड जेल पर किया गया था। जैसा कि चित्र 3सी में दर्शाया गया है, आरएएवी कैप्सिड प्रोटीन का प्रतिनिधित्व करने वाले केवल तीन बैंड आरएएवी 1/2 तैयारी के लिए देखे गए थे और कोई पता लगाने योग्य सह-शुद्ध प्रोटीन की पहचान नहीं की गई थी। ये परिणाम आरएएवी 2/9 (पूरक चित्रा एस 2 सी) के लिए प्राप्त लोगों के अनुरूप थे। पहचान की पुष्टि करने और rAAV1/2 और rAAV2/9 वैक्टर की शुद्धता को और अधिक चिह्नित करने के लिए, वायरल अंशों और केंद्रित स्टॉक का विश्लेषण पश्चिमी धब्बा द्वारा किया गया था, विशिष्ट एंटीबॉडी B1 (पूरक चित्र S3A और पूरक चित्र S4A) और A69 (अनुपूरक चित्र S3B और पूरक चित्र S4B)। जबकि एंटीबॉडी बी 1 अधिकांश एएवी सीरोटाइप62 के सभी वीपी प्रोटीन के लिए सामान्य सी-टर्मिनल एपिटोप को पहचानता है, क्लोन ए 6 9 केवल वीपी 1 और वीपी 263 के एपिटोप्स को पहचानता है। बहरहाल, वीपी 3 (<62 केडीए) से कम आणविक भार वाले कुछ बेहोश बैंड भी बी 1 और ए 69 लेबलिंग पर पता लगाया जा सकता है।

संरचनात्मक आकृति विज्ञान को चिह्नित करने और आरएएवी की शुद्धता का मूल्यांकन करने के लिए, वायरल कणों को सीधे टीईएम द्वारा देखा गया था। यह तकनीक वायरल नमूनों में नमूना अखंडता और शुद्धता का आकलन करने के लिए मानक प्रक्रिया रही है, क्योंकि यह खाली और पूर्ण आरएएवी कणों की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है, साथ ही नमूना 29,64,65,66,67में संदूषण का आकलन करता है। जैसा कि चित्र 3डी में दिखाया गया है, बड़ी मात्रा में आरएएवी कण, ~ 25 एनएम व्यास, एक साफ पृष्ठभूमि पर देखा जा सकता है। एक इलेक्ट्रॉन-घने केंद्र के साथ खाली कण (काला तीर), साथ ही पूर्ण वैक्टर (सफेद तीर) भी नमूना क्षेत्र में देखा जा सकता है।

हमने स्टनर का उपयोग करके शुद्ध आरएएवी का गुणवत्ता नियंत्रण भी किया, एक ऐसा मंच जो पराबैंगनी-दृश्यमान (यूवी-विज़) स्पेक्ट्रोस्कोपी, स्थिर प्रकाश प्रकीर्णन (एसएलएस), और गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन (डीएलएस)68को जोड़ता है। प्रत्येक नमूने के लिए, प्रोटीन की कुल मात्रा, एसएसडीएनए, साथ ही अशुद्धियों और पृष्ठभूमि मैलापन को अवशोषित करना, यूवी-विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी(चित्रा 3ई और पूरक चित्रा एस5ए)द्वारा मापा गया था। एसएलएस और डीएलएस को तब आरएएवी कैप्सिड के प्रकाश-प्रकीर्णन व्यवहार का आकलन करने के लिए लागू किया गया था। यह देखते हुए कि एएवी का औसत व्यास 25 एनएम है, 15-45 एनएम व्यास सीमा के भीतर कणों को बरकरार माना जाता है। बड़े कणों आम तौर पर वायरल समुच्चय का प्रतिनिधित्व करते हैं, और सब कुछ छोटे सबसे अधिक संभावना छोटे कणों को शामिल करते हैं, जिसमें अनसेम्बल्ड कैप्सिड प्रोटीन68 शामिल हैं। आरएएवी 1/2 के लिए, बरकरार कैप्सिड कणों के अनुरूप एक एकल चोटी 30 एनएम (चित्रा 3 एफ) पर देखी गई थी, जिसमें कुल तीव्रता का 0% और छोटे कण तीव्रता का 0% था। आरएएवी 2/9 तैयारी के लिए, 30 एनएम पर एक चोटी भी 78% कैप्सिड तीव्रता (पूरक चित्रा एस 5 बी) का प्रतिनिधित्व करती है। भले ही छोटे कण तीव्रता 0% थी, इस नमूने के लिए, 22% की कुल तीव्रता को मापा गया था (ग्रे में दर्शाया गया है), 620 एनएम (पूरक चित्रा एस 5 बी) के औसत व्यास के साथ बड़े समुच्चय से प्रमुख योगदान (19.9%) के साथ। एसएलएस और डीएलएस जानकारी के साथ यूवी-विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी के संयोजन के माध्यम से, स्टनर ने समग्र कुल कैप्सिड टिटर, पूर्ण कैप्सिड टिटर, मुक्त और एकत्रित प्रोटीन, साथ ही दो वायरल तैयारियों के लिए मुफ्त और एकत्रित एसएसडीएनए का खुलासा किया, जो चित्रा 3 जी और पूरक चित्रा एस 5 सी (प्रत्येक आंकड़ा किंवदंती में इंगित विशिष्ट मूल्यों) में दिखाया गया है।

समानांतर में, विकसित मोज़ेक एएवी वैक्टर की जैविक गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए, HEK293T कोशिकाओं को आरएएवी 1/2 या आरएएवी 2/9 तैयारी के प्रत्येक एफपीएलसी-प्राप्त अंश (एफ 2-एफ 16) के 50 माइक्रोन से संक्रमित किया गया था। चूंकि आरएएवी 1/2 वेक्टर सीएमवी प्रमोटर (पीएएवी-सीएमवी-एसएसजीएफपी) के नियंत्रण में एकल-स्ट्रैंड ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) को एन्कोड करता है, और आरएएवी 2/9 वेक्टर सीएमवी प्रमोटर (पीएएवी-सीएमवी-एससीजीएफपी53) के नियंत्रण में एक स्व-पूरक जीएफपी को एन्कोड करता है, प्रत्यक्ष जीएफपी प्रतिदीप्ति की जांच इन कोशिकाओं में 48 घंटे के बाद संक्रमण (पूरक चित्रा एस 6 और पूरक चित्रा एस 7) में की गई थी). RT-qPCR, Coomassie ब्लू और वेस्टर्न ब्लॉट के लिए पिछले अवलोकनों के अनुरूप, वायरल अंशों F7 और F8 के लिए उच्चतम संक्रामकता स्तर हासिल किया गया था, धीरे-धीरे अंशों F9 से F16 में कमी आ रही थी।

यह पुष्टि करने के लिए कि क्या आरएएवी की जैविक गतिविधि को अल्ट्राफिल्ट्रेशन और एकाग्रता चरणों के बाद बनाए रखा गया था, न्यूरो 2 ए कोशिकाएं, दोनों 24-अच्छी प्लेटों और 8-अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड में चढ़ाया गया था, सीएमवी प्रमोटर (पीएएवी-सीएमवी-एससीजीएफपी53) के नियंत्रण में एससीजीएफपी को एन्कोडिंग करते हुए केंद्रित आरएएवी 1/2 वेक्टर से संक्रमित थे। ब्राइटफील्ड और प्रतिदीप्ति छवियों को 48 घंटे के बाद संक्रमण (चित्रा 4 ए, बी उच्च संकल्प छवियों के लिए) का अधिग्रहण किया गया था।

एक अधिक प्रासंगिक और चिंतनशील सेल मॉडल में उत्पादित आरएएवी की संक्रामक क्षमता का पता लगाने के उद्देश्य से, प्रांतस्था से अर्ध-घने प्राथमिक न्यूरोनल संस्कृतियों को 12-अच्छी प्लेट पर वरीयता दी गई थी और पहले इस्तेमाल किए गए आरएएवी 1/2 - सीएमवी-एससीजीएफपी से संक्रमित किया गया था। संक्रमण के अड़तालीस घंटे बाद, कोशिकाओं को तय किया गया और एलेक्सा फ्लोर 633 के साथ संयुग्मित डीएपीआई और डब्ल्यूजीए के साथ लेबल किया गया, स्थिर कोशिकाओं को लेबल करने के लिए व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला लेक्टिन। चित्रा 4C, D में दिखाए गए चित्र Zeiss Axio Observer Z1 के साथ और Zeiss confocal LSM 710 पर अधिग्रहित किए गए थे। जैसा कि प्रत्यक्ष जीएफपी प्रतिदीप्ति द्वारा इन आंकड़ों में दर्शाया गया है, केंद्रित मोज़ेक वायरस न्यूरोनल कोशिकाओं के लिए अपने जीन स्थानांतरण गुणों को संरक्षित करते हैं।

शुद्धता, भौतिक गुणों और इन विट्रो में कार्यक्षमता के संदर्भ में मोज़ेक आरएएवी की विशेषता होने के बाद, हमने अगली बार C57BL/6 चूहों के सेरिबैलम को प्रसारित करने के लिए शुद्ध rAAV1/2 मोज़ेक वैक्टर का उपयोग करने की संभावना का मूल्यांकन किया। उसके लिए, 9 सप्ताह के चूहों में एक स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन किया गया था और 12 सप्ताह बाद जीएफपी अभिव्यक्ति का मूल्यांकन किया गया था। जैसा कि प्रत्याशित था, पीबीएस के साथ इंजेक्शन वाले जानवरों ने जीएफपी इम्यूनोलेबलिंग पर कोई प्रतिदीप्ति प्रदर्शित नहीं की। synapsin 1 प्रमोटर (rAAV1/2 - Syn-ssGFP) के नियंत्रण में GFP एन्कोडिंग GFP एन्कोडिंग चूहों से चूहों से epifluorescence छवियों से पता चला है कि rAAV1/2 वैक्टर सफलतापूर्वक सेरिबैलम के कई क्षेत्रों, अर्थात् गहरी अनुमस्तिष्क नाभिक (DCN) क्षेत्र, साथ ही सेरिबैलम (चित्रा 5) के विभिन्न lobules पारित. ये परिणाम स्तनधारी मस्तिष्क (12 सप्ताह) में ट्रांसजीन की लंबी अभिव्यक्ति को प्रदर्शित करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: आरएएवी उत्पादन और शुद्धि प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। आरएएवी पॉलीइथाइलेनिमाइन (पीईआई) का उपयोग करके HEK293T कोशिकाओं के क्षणिक अभिकर्मक द्वारा निर्मित होते हैं। इसके बाद, कोशिकाओं को काटा जाता है और lysed किया जाता है, और rAAVs को एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से सेल होमोजेनेट से शुद्ध किया जाता है। आरएएवी युक्त एकत्रित अंशों को तब केंद्रित किया जाता है, और अंतिम वायरल स्टॉक को टिटर, शुद्धता, रूपात्मक विशेषताओं और जैविक गतिविधि के संदर्भ में विशेषता होती है। संक्षिप्ताक्षर: rAAV = पुनः संयोजक एडेनो-जुड़े वायरस; पीईआई = पॉलीथीनमाइन; RT-qPCR = वास्तविक समय मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन; एसडीएस-पेज = सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एफपीएलसी शुद्धि प्रोटोकॉल और आरएएवी 1/2 का प्रतिनिधि क्षालन प्रोफाइल। (ए) एक पूर्ण क्रोमैटोग्राम प्रोफ़ाइल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व, आरएएवी शुद्धि प्रक्रिया के विभिन्न चरणों को दर्शाता है। कॉलम संतुलन चरण के बाद, नमूना लागू किया जाता है। स्तंभ तो धोया जाता है, और क्षालन NaCl की बढ़ती सांद्रता के साथ किया जाता है. अनबाउंड सामग्री (फ्लोथ्रू) और एल्यूटेड वायरस के 1 एमएल अंश विश्लेषण के लिए एकत्र किए जाते हैं। 280 एनएम पर अवशोषण एमएयू में व्यक्त किया जाता है और एक्स-अक्ष एमएल में मात्रा को इंगित करता है। (बी) बढ़े हुए आंशिक क्रोमैटोग्राम एक आरएएवी 1/2 क्षालन शिखर (काले रंग में) दिखा रहा है, इसी अंश संख्या (एफ 2-एफ 16) और अपशिष्ट (लाल रंग में इंगित) के साथ। बफर बी और चालकता (एमएस / सेमी में व्यक्त) की जारी एकाग्रता भी क्रमशः हरे और बैंगनी रंग में दिखाए जाते हैं। (सी) आत्मीयता शुद्धि (एफ 2-एफ 16) और प्रवाह के दौरान एकत्र किए गए प्रत्येक अंश का आरटी-क्यूपीसीआर। vg/μL में टिटर को लघुगणकीय पैमाने पर दर्शाया जाता है। (डी) एकत्रित वायरल अंशों का एसडीएस-पेज विश्लेषण। क्षालन चरण (F2-F16) से प्रत्येक अंश के बराबर मात्रा (40 μL), और संबंधित प्रवाह लोड किए गए और 10% एसडीएस-पॉलीक्रिलामाइड जेल पर हल किए गए। प्रोटीन बैंड Coomassie नीले धुंधला द्वारा कल्पना की गई थी. AAV कैप्सिड प्रोटीन VP1, VP2 और VP3 से संबंधित बैंड इंगित किए गए हैं। मानक प्रोटीन आकार सीढ़ी को (एल) के रूप में नामित किया गया है और इसी आणविक भार को भी इंगित किया गया है। संक्षिप्ताक्षर: rAAV = पुनः संयोजक एडेनो-जुड़े वायरस; RT-qPCR = वास्तविक समय मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन; एसडीएस-पेज = सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: केंद्रित आरएएवी 1/2 वैक्टर की विशेषता। (ए) एक केंद्रित आरएएवी 1/2 नमूने (नीले रंग में) के प्रवर्धन घटता, 2 × 107 वीजी / माइक्रोन से 2 × 102 वीजी / माइक्रोन (काले रंग में) और आरटी-क्यूपीसीआर के दौरान प्राप्त नो-टेम्पलेट नियंत्रण (हरे रंग में) से क्रमिक रूप से पतला मानक। (बी) वीजी/μएल में आरएएवी नमूने के टिटर के निर्धारण के लिए मानक वक्र (रैखिक प्रतिगमन)। (सी) केंद्रित वायरल कणों का एसडीएस-पेज विश्लेषण। केंद्रित स्टॉक के कुल 2.3 ×10 10 वीजी जेल पर जमा किए गए थे। (डी)~25-30 एनएम व्यास के साथ आरएएवी 1/2 कणों की ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवि। इलेक्ट्रॉन-घने केंद्र (काले तीरों द्वारा प्रमाणित) वाले खाली कणों को पूर्ण कैप्सिड (सफेद तीरों द्वारा प्रमाणित) से अलग किया जा सकता है। स्केल बार = 100 एनएम। (ई) स्टनर (काले रंग में) द्वारा मापा गया आरएएवी 1/2 तैयारी का अवशोषण स्पेक्ट्रम। प्रोटीन (नीले रंग में), ssDNA (हरे रंग में), अन्य यूवी-अवशोषित यौगिकों या अशुद्धियों (बैंगनी में), और पृष्ठभूमि मैलापन (ग्रे में) का योगदान भी दिखाया गया है। (एफ) स्टनर द्वारा मापा गया 30 एनएम पर एकल चोटी के साथ आरएएवी 1/2 का डीएलएस तीव्रता वितरण। 100% की एक कैप्सिड प्रकीर्णन तीव्रता 15 से 45 एनएम (छायांकित हरे) से वक्र के तहत क्षेत्र को मापकर निर्धारित की गई थी। (जी) आरएएवी 1/2 वेक्टर तैयारी का स्टनर विश्लेषण 1.19 × 1014 सीपी/एमएल (गहरा नीला) और 1.73 × 1013 वीजी/एमएल (गहरा हरा) का एक पूर्ण कैप्सिड टिटर प्रदर्शित करता है। 7.16 × 1012 सीपी/एमएल समकक्ष (हल्का नीला) का एक स्वतंत्र और एकत्रित प्रोटीन, साथ ही 1.04 × 1012 वीजी/एमएल समकक्ष (हल्का हरा) का एक स्वतंत्र और एकत्रित एसएसडीएनए भी मापा गया। संक्षिप्ताक्षर: rAAV = पुनः संयोजक एडेनो-जुड़े वायरस; RT-qPCR = वास्तविक समय मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन; एसडीएस-पेज = सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन; ssDNA = एकल-फंसे डीएनए; DLS = गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एक केंद्रित आरएएवी 1/2 नमूने के इन विट्रो संक्रामकता मूल्यांकन में। (ए) न्यूरो 2 ए कोशिकाओं को आरएएवी 1/2 - सीएमवी-एससीजीएफपी से संक्रमित किया गया था या नकारात्मक नियंत्रण के रूप में पीबीएस के बराबर मात्रा के साथ इनक्यूबेट किया गया था। कोशिकाओं की ब्राइटफील्ड और प्रतिदीप्ति छवियों 48 घंटे के बाद संक्रमण imaged. छवियाँ एक Zeiss Axio Observer Z1 (10x उद्देश्य) में अधिग्रहित की गई थीं। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन। (बी) न्यूरो 2 ए कोशिकाओं की विस्तृत छवियों 48 घंटे आरएएवी 1/2 के साथ संक्रमण के बाद - सीएमवी-एससीजीएफपी। छवियों को ज़ीस एलएसएम 710 (40x उद्देश्य) में अधिग्रहित किया गया था। स्केल सलाखों = 20 माइक्रोन। (सी) अर्ध घने प्राथमिक न्यूरोनल संस्कृतियों rAAV1/2 से संक्रमित - सीएमवी-scGFP या पीबीएस के बराबर मात्रा के साथ ऊष्मायन, एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवारत. कोशिकाओं को एक परमाणु दाग (नीले रंग में डीएपीआई ) और एक झिल्ली दाग (सफेद में डब्ल्यूजीए) के साथ लेबल किया गया था। छवियों को Zeiss Axio Observer Z1 (40x उद्देश्य) में अधिग्रहित किया गया था। स्केल सलाखों = 20 माइक्रोन। (डी) अर्द्ध घने प्राथमिक न्यूरोनल संस्कृतियों की विस्तृत छवियों 48 घंटे rAAV1/2 के साथ संक्रमण के बाद - सीएमवी-scGFP. छवियों एक Zeiss LSM 710 (40x उद्देश्य) में अधिग्रहण किया गया. स्केल सलाखों = 20 माइक्रोन. संक्षिप्ताक्षर: rAAV = पुनः संयोजक एडेनो-जुड़े वायरस; सीएमवी = साइटोमेगालोवायरस; scGFP = स्व-पूरक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन; पीबीएस = फॉस्फेट-बफर खारा; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole; WGA = गेहूं के रोगाणु agglutinin। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: एक इंट्रापैरेन्काइमल इंजेक्शन के बाद आरएएवी 1/2 की विवो ट्रांसडक्शन दक्षता में। प्रतिनिधि immunofluorescence छवियों rAAV1/2 के एक केंद्रीय इंजेक्शन पर सेरिबैलम भर में व्यापक GFP अभिव्यक्ति (हरे रंग में) दिखा - सेरिबैलम में Syn-ssGFP. नाभिक DAPI (नीले रंग में) के साथ दाग रहे थे। स्केल सलाखों = 500 माइक्रोन. संक्षिप्ताक्षर: rAAV = पुनः संयोजक एडेनो-जुड़े वायरस; सिन = सिनैप्सिन 1; ssGFP = सिंगल-स्ट्रैंड ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole; पीबीएस = फॉस्फेट बफर खारा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 1: एसएमएआई के साथ पचाए गए आरएएवी वेक्टर प्लाज्मिड का अगारोज जेल विश्लेषण। एक pITR के छह क्लोन (C1-C6) SmaI प्रतिबंध एंजाइम (लेन 2, 4, 6, 8, 10, और 12) के साथ पचा रहे थे, जो प्रत्येक उल्टे टर्मिनल दोहराने के भीतर दो बार कटौती करता है. इस मामले में, इस pITR के पूर्ण पाचन से दो बैंड (3,796 bp और 3,013 bp) उत्पन्न होने की उम्मीद होगी. सफल तैयारी (सी 1, सी 3, सी 4, और सी 5) में 6809 बीपी का एक बैंड, आंशिक पाचन से उत्पन्न अभी भी दिखाई देता है (कुल का ~ 5%)। आईटीआर पुनर्संयोजन के साथ तैयारी में, अनुपात उलट (सी 2) हैं, या पाचन नहीं हुआ (सी 6)। संबंधित गैर-पचाने वाले क्लोन भी प्रस्तुत किए जाते हैं (लेन 3, 5, 7, 9, 11, 13)। संक्षिप्ताक्षर: rAAV = पुनः संयोजक एडेनो-जुड़े वायरस; ITR = इनवर्टेड टर्मिनल रिपीट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 2: हेपरिन-आधारित आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी द्वारा आरएएवी 2/9 शुद्धि। (ए) एनएसीएल की एकाग्रता में वृद्धि के बाद एक एकल चोटी (काले रंग में) प्रदर्शित करने वाले आरएएवी 2/9 की क्षालन प्रोफाइल। एकत्रित अंशों को ग्राफ के निचले भाग में लाल रंग में संख्याओं (2-16) द्वारा इंगित किया जाता है, 280 एनएम पर अवशोषण को एमएयू में व्यक्त किया जाता है, चालकता एमएस/सेमी में व्यक्त की जाती है, और एक्स-अक्ष एमएल में मात्रा को इंगित करता है। (बी) प्रत्येक पूल किए गए अंश (एफ 2-एफ 16) और प्रवाह के लिए आरटी-क्यूपीसीआर द्वारा निर्धारित आरएएवी टाइटर्स। मानों को लघुगणकीय पैमाने पर दर्शाया जाता है। (सी) एसडीएस-पेज और कूमासी ब्लू स्टेनिंग द्वारा शुद्धता परख। प्रत्येक अंश (F2-F16) के बराबर वॉल्यूम (40 μL) और संबंधित फ्लोथ्रू को लोड किया गया और 10% SDS-PAGE पर हल किया गया। केंद्रित स्टॉक आरटी-क्यूपीसीआर द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया था और 2.3 × 1010 वीजी पीबीएस के 40 माइक्रोन में पतला किया गया था और जेल पर जमा किया गया था। प्रोटीन बैंड Coomassie नीले धुंधला द्वारा कल्पना की गई थी. एएवी कैप्सिड प्रोटीन (वीपी 1, वीपी 2, और वीपी 3) का संकेत दिया जाता है। मानक प्रोटीन आकार सीढ़ी (एल) के साथ नामित किया गया है और इसी आणविक भार भी संकेत दिया जाता है. संक्षिप्ताक्षर: rAAV = पुनः संयोजक एडेनो-जुड़े वायरस; RT-qPCR = वास्तविक समय मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन; एसडीएस-पेज = सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा एस 3: एफपीएलसी द्वारा शुद्ध आरएएवी 1/2 वैक्टर का पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। (ए)एकत्रित अंशों और केंद्रित आरएएवी 1/2 वैक्टर को एसडीएस-पेज जेल पर हल किया गया था और माउस मोनोक्लोनल एंटी-एएवी एंटीबॉडी (बी 1) के साथ जांच की गई थी जो वीपी 1, वीपी 2 और वीपी 3 कैप्सिड प्रोटीन को पहचानता है। (बी) एकत्रित अंशों और केंद्रित आरएएवी 1/2 वैक्टर को एसडीएस-पेज जेल पर हल किया गया था और माउस मोनोक्लोनल एंटी-एएवी एंटीबॉडी (ए 6 9) के साथ जांच की गई थी जो वीपी 1 और वीपी 2 कैप्सिड प्रोटीन को पहचानता है। संक्षिप्ताक्षर: rAAV = पुनः संयोजक एडेनो-जुड़े वायरस; FPLC = तेज प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी; एसडीएस-पेज = सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन; एल = मानक प्रोटीन आकार सीढ़ी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा एस 4: एफपीएलसी द्वारा शुद्ध आरएएवी 2/9 वैक्टर का पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। (ए) एकत्रित अंशों और केंद्रित आरएएवी 2/9 वैक्टर को एसडीएस-पेज जेल पर हल किया गया था और माउस मोनोक्लोनल एंटी-एएवी एंटीबॉडी (बी 1) के साथ जांच की गई थी जो वीपी 1, वीपी 2 और वीपी 3 कैप्सिड प्रोटीन को पहचानता है। (बी)एकत्रित अंशों और केंद्रित आरएएवी 2/9 वैक्टर को एसडीएस-पेज जेल पर हल किया गया और माउस मोनोक्लोनल एंटी-एएवी एंटीबॉडी (ए 6 9) के साथ जांच की गई जो वीपी 1 और वीपी 2 कैप्सिड प्रोटीन को पहचानता है। संक्षिप्ताक्षर: rAAV = पुनः संयोजक एडेनो-जुड़े वायरस; FPLC = तेज प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी; एसडीएस-पेज = सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन; एल = मानक प्रोटीन आकार सीढ़ी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 5: आरएएवी 2/9 वेक्टर मात्रा का ठहराव और स्टनर के माध्यम से लक्षण वर्णन। (ए) स्टनर द्वारा मापा गया आरएएवी 2/9 वेक्टर का अवशोषण स्पेक्ट्रम (काला)। प्रोटीन (नीला), ssDNA (हरा), अन्य यूवी-अवशोषित यौगिकों या अशुद्धियों (बैंगनी), और पृष्ठभूमि मैलापन (ग्रे) का योगदान भी दर्शाया गया है। (बी) आरएएवी 2/9 की डीएलएस तीव्रता वितरण 30 एनएम पर एक प्रमुख चोटी के साथ 78% की कैप्सिड प्रकीर्णन तीव्रता के अनुरूप है, जैसा कि वक्र के तहत क्षेत्र को 15 से 45 एनएम (छायांकित हरा) से मापकर निर्धारित किया गया है। 22% (ग्रे में छायांकित) की कुल कुल तीव्रता भी 620 एनएम के औसत व्यास के साथ बड़े समुच्चय (19.9%) से मुख्य योगदान के साथ मापा गया था। (सी) आरएएवी 2/9 वेक्टर तैयारी का स्टनर विश्लेषण 2.18 × 1014 सीपी/एमएल (गहरा नीला) और 2.35 × 1013 वीजी / एमएल (गहरा हरा) का एक पूर्ण कैप्सिड टिटर प्रदर्शित करता है। 2.92 × 1013 सीपी/एमएल समकक्ष (हल्का नीला) का एक स्वतंत्र और एकत्रित प्रोटीन, साथ ही 3.14 × 1012 वीजी/एमएल समकक्ष (हल्का हरा) का एक स्वतंत्र और एकत्रित एसएसडीएनए भी इस तैयारी में मापा गया था। संक्षिप्ताक्षर: rAAV = पुनः संयोजक एडेनो-जुड़े वायरस; ssDNA = एकल-फंसे डीएनए; DLS = गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र S6: इन विट्रो ट्रांसडक्शन दक्षता और rAAV1/2 के शुद्ध अंशों की व्यवहार्यता। HEK293T जीएफपी (प्रत्यक्ष प्रतिदीप्ति) को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को आरएएवी 1/2 वेक्टर एन्कोडिंग एसएसजीएफपी (आरएएवी 1/2 - सीएमवी-एसएसजीएफपी) के एफपीएलसी अंशों के 50 माइक्रोन के साथ पारगमन के बाद 48 घंटे। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन. संक्षिप्ताक्षर: rAAV = पुनः संयोजक एडेनो-जुड़े वायरस; FPLC = तेज प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी; ssGFP = सिंगल-स्ट्रैंड ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र S7: इन विट्रो ट्रांसडक्शन दक्षता और rAAV2/9 के शुद्ध अंशों की व्यवहार्यता। HEK293T कोशिकाएं सीएमवी प्रमोटर के नियंत्रण में प्रत्येक एफपीएलसी अंश (एफ 2-एफ 16) के 50 माइक्रोन या आरएएवी 2/9 वेक्टर एन्कोडिंग एससीजीएफपी के प्रवाह से संक्रमित थीं। जीएफपी-व्यक्त कोशिकाओं को संक्रमण के बाद 48 घंटे की कल्पना की गई थी। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन. संक्षिप्ताक्षर: rAAV = पुनः संयोजक एडेनो-जुड़े वायरस; FPLC = तेज प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी; scGFP = स्व-पूरक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन; सीएमवी = साइटोमेगालोवायरस। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

तेजी से विस्तार करने वाला एएवी वेक्टर टूलकिट प्रशासन के विभिन्न मार्गों के माध्यम से सेल प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए सबसे आशाजनक जीन वितरण प्रणालियों में से एक बन गया है। इस काम में, हमने मोज़ेक आरएएवी वैक्टर के उत्पादन, शुद्धिकरण और लक्षण वर्णन के लिए एक बेहतर प्रोटोकॉल विकसित करने का लक्ष्य रखा है जो प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में उनके मूल्य को साबित कर सकता है। उस प्रयोजन के लिए, rAAV1/2 और rAAV2/9 मोज़ेक वैक्टर की पीढ़ी यहाँ वर्णित है, लेकिन प्रक्रिया भी मानक rAAV2 वैक्टर (डेटा नहीं दिखाया गया) शुद्ध करने के लिए लागू किया जा सकता है.

मोज़ेक आरएएवी को एक अभिकर्मक अभिकर्मक के रूप में पीईआई का उपयोग करके एक अनुकूलित अभिकर्मक विधि के बाद उत्पादित किया गया था। एक क्षणिक अभिकर्मक विधि अपने अधिक से अधिक लचीलापन और गति, प्रारंभिक चरण पूर्व नैदानिक अध्ययन में काफी फायदे के कारण चुना गया था. एक बार एक विशेष ट्रांसजीन और सीरोटाइप मान्य किया गया है, उत्पादन प्रणाली ठीक ट्यून किया जा सकता है एक स्थिर ट्रांसफ़ेक्ट सेल लाइन है कि विशिष्ट प्रतिनिधि / कैप जीन के एक सबसेट व्यक्त की स्थापना के द्वारा बेहतर मापनीयता और लागत प्रभावशीलता प्राप्त करने के लिए, अतिरिक्त जीन के साथ एक संक्रमण प्रक्रिया24 द्वारा प्रदान की जाती है. कैल्शियम-फॉस्फेट अभिकर्मक की तुलना में, पीईआई कई फायदे प्रस्तुत करता है। यह एक स्थिर और लागत प्रभावी अभिकर्मक अभिकर्मक है जो व्यापक पीएच रेंज के भीतर प्रभावी ढंग से संचालित होता है। इसके अतिरिक्त, यह अभिकर्मक के बाद सेल माध्यम को बदलने की आवश्यकता को समाप्त करता है, जिसके परिणामस्वरूप लागत और कार्यभार दोनों में उल्लेखनीय कमीआती है।

CsCl या iodixanol ग्रेडिएंट द्वारा लगाई गई कुछ सीमाओं को दरकिनार करने के प्रयास में, उत्पादित rAAV को एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी द्वारा काटा और शुद्ध किया गया था। यह रणनीति एक सरलीकृत और स्केलेबल दृष्टिकोण प्रदान करती है जिसे अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन और ग्रेडिएंट की आवश्यकता के बिना किया जा सकता है, जिससे स्वच्छ और उच्च वायरल टाइटर्स मिलते हैं। दरअसल, एफपीएलसी प्रणाली का उपयोग करके क्रोमैटोग्राफी तकनीकों को स्वचालित किया जा सकता है और उच्च बिस्तर ऊंचाई वाले कॉलम में अधिक राल मात्रा पैक करके बढ़ाया जा सकता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल को 5 एमएल हाईट्रैप हेपरिन एचपी कॉलम (डेटा नहीं दिखाया गया) को शामिल करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, हेपरिन कॉलम को कई बार पुन: उपयोग किया जा सकता है, इस प्रकार इस पद्धति की लागत-प्रभावशीलता में योगदान होता है।

शुद्ध आरएएवी को तब अनुमापक, शुद्धता, रूपात्मक विशेषताओं और जैविक गतिविधि के संदर्भ में चित्रित किया गया था। दिलचस्प बात यह है कि कूमासी ब्लू स्टेनिंग में, लगभग 17 केडीए वाला एक बैंड तीन विशिष्ट वायरल कैप्सिड प्रोटीन के अलावा अंशों एफ 8-एफ 16 में पाया गया था। हालांकि, यह बैंड आरएएवी के एकाग्रता चरण के बाद मौजूद नहीं है। इसके अलावा, वीपी 3 (<62 केडीए) से कम आणविक भार वाले कुछ बेहोश बैंड भी बी 1 और ए 69 लेबलिंग पर पता लगाया जा सकता है, यह सुझाव देते हुए कि ये वीपी 1, वीपी 2 और वीपी 3 कैप्सिड प्रोटीन70 के टुकड़े हो सकते हैं। एक और संभावना यह है कि ये वास्तव में पॉलीपेप्टाइड्स के साथ फेरिटिन या अन्य सेलुलर प्रोटीन जैसे अन्य सह-शुद्ध प्रोटीन हैं जो एएवी कैप्सिड प्रोटीन के साथ समान प्रोटीन फिंगरप्रिंट साझा करते हैं और एएवी जीव विज्ञान में शामिल हो सकते हैं, जैसा कि पहले 26,71,72का सुझाव दिया गया था।

टीईएम और स्टनर विश्लेषण ने विभिन्न प्रस्तुतियों में चर स्तरों पर खाली कणों की उपस्थिति का भी खुलासा किया। इसी तरह, अन्य अध्ययनों से पहले अभिकर्मक या संक्रमण विधियों24,73 द्वारा तैयार rAAV के लिए खाली capsids के चर और उच्च स्तर (>65%) की पीढ़ी की सूचना दी. आरएएवी पीढ़ी के पीछे तंत्र नए संश्लेषित वीपी प्रोटीन से खाली कैप्सिड के तेजी से गठन के साथ शुरू होता है, इसके बाद रेप प्रोटीन74,75 द्वारा मध्यस्थता वाले पूर्ववर्ती कैप्सिड में जीनोम पैकेजिंग की धीमी दर-सीमित कदम होता है। इसलिए, खाली कैप्सिड आरएएवी प्रस्तुतियों में उत्पन्न होते हैं, हालांकि खाली और पूर्ण कैप्सिड का अनुपात ब्याज और सेल संस्कृति की स्थिति 58,73के ट्रांसजीन के आकार और अनुक्रम के आधार पर भिन्न हो सकता है। खाली कैप्सिड कुछ चिंताओं को उठाते हैं, क्योंकि ब्याज के जीनोम की कमी से, वे एक चिकित्सीय प्रभाव प्रदान करने में असमर्थ हैं और संभावित रूप से एक जन्मजात या अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया भी बढ़ा सकते हैं। हालांकि, कुछ रिपोर्टों से यह भी पता चला है कि, उनके अनुपात को समायोजित करके, खाली एएवी कैप्सिड एएवी-विशिष्ट न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडी के लिए अत्यधिक प्रभावी डिकॉय के रूप में काम कर सकते हैं और इसलिए, पारगमन क्षमता60,76,77में वृद्धि कर सकते हैं। यदि खाली कैप्सिड की उपस्थिति गंभीर रूप से हानिकारक है और पूर्ण वैक्टर की तुलना में खाली कणों के थोड़ा कम आयनिक चरित्र को देखते हुए, एक संभावित समाधान में आयनों विनिमय क्रोमैटोग्राफी तकनीकों64का उपयोग करके एक दूसरा चमकाने शुद्धिकरण चरण का संचालन करना शामिल हो सकता है।

यह अध्ययन सम्मोहक साक्ष्य भी प्रदान करता है कि उत्पन्न मोज़ेक आरएएवी न केवल इन विट्रो न्यूरोनल संस्कृतियों में बल्कि आरएएवी 1/2 के इंट्राक्रैनील इंजेक्शन पर सीएनएस को कुशलतापूर्वक प्रसारित करने में सक्षम हैं। कुल मिलाकर, इन परिणामों से पता चलता है कि वर्णित उत्पादन और शुद्धिकरण प्रोटोकॉल 6 दिनों में उपयोग करने के लिए तैयार अत्यधिक शुद्ध और जैविक रूप से सक्रिय आरएएवी प्रदान करता है, जो खुद को प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में आरएएवी की पीढ़ी के लिए एक बहुमुखी और लागत प्रभावी विधि के रूप में पेश करता है।

Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

हम आरएएवी के टीईएम विश्लेषण के संबंध में कोयम्बरा इंस्टीट्यूट फॉर क्लिनिकल एंड बायोमेडिकल रिसर्च (आईसीबीआर) और सेंटर फॉर इनोवेटिव बायोमेडिसिन एंड बायोटेक्नोलॉजी (सीआईबीबी) में डॉ. मोनिका ज़ुज़ार्टे द्वारा प्रदान किए गए सहयोग, अंतर्दृष्टि और तकनीकी सहायता के लिए आभारी हैं। हम कोयम्बरा विश्वविद्यालय (सीएनसी-यूसी) के सेंटर फॉर न्यूरोसाइंस एंड सेल बायोलॉजी और कोयम्बरा विश्वविद्यालय (IIIUC) के अंतःविषय अनुसंधान संस्थान में डॉ. डोमिनिक फर्नांडीस को उनकी अमूल्य तकनीकी सहायता और अंतर्दृष्टि के लिए अपनी प्रशंसा का विस्तार करते हैं। इस अध्ययन के लिए आवश्यक pRV1, pH21, और pFdelta6 प्लास्मिड, स्कूल ऑफ मेडिकल साइंसेज, कॉलेज ऑफ लाइफ साइंसेज एंड मेडिसिन, एबरडीन विश्वविद्यालय में डॉ. क्रिस्टीना मैकक्लर द्वारा उदारतापूर्वक प्रदान किए गए थे, जिसके लिए हम आभारी हैं। इस काम को यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष (ईआरडीएफ) द्वारा सेंट्रो 2020 क्षेत्रीय परिचालन कार्यक्रम के माध्यम से वित्त पोषित किया गया था; COMPETE 2020 के माध्यम से - प्रतिस्पर्धात्मकता और अंतर्राष्ट्रीयकरण के लिए परिचालन कार्यक्रम, और FCT के माध्यम से पुर्तगाली राष्ट्रीय निधि - Fundação para a Ciência e a Tecnologia, परियोजनाओं के तहत: UIDB/04539/2020, UIDP/04539/2020, LA/P/0058/2020, ViraVector (CENTRO-01-0145-FEDER-022095), Imagene (PTDC/BBB-NAN/0932/2014 | POCI-01-0145-FEDER-016807), रीसेट - IDT-COP (CENTRO-01-0247-FEDER-070162), फाइटिंग Sars-CoV-2 (CENTRO-01-01D2-FEDER-000002), BDforMJD (CENTRO-01-0145-FEDER-181240), ModelPolyQ2.0 (CENTRO-01-0145-FEDER-181258), MJDEDIT (CENTRO-01-0145-FEDER-181266); अमेरिकन पुर्तगाली बायोमेडिकल रिसर्च फंड (APBRF) और रिचर्ड चिन और लिली लॉक मचाडो-जोसेफ डिजीज रिसर्च फंड, ARDAT द्वारा IMI2 JU ग्रांट एग्रीमेंट No 945473 के तहत EU और EFPIA द्वारा समर्थित; जीन-टीमिंग प्रोजेक्ट यूरोपीय संघ के क्षितिज यूरोप कार्यक्रम द्वारा समर्थित 101059981। एमएमएल 2021.05776.BD द्वारा समर्थित था; सीएच को 2021.06939.BD द्वारा समर्थित किया गया था; ए.सी.एस. 2020.07721.BD द्वारा समर्थित किया गया था; और डीडीएल 2020.09668.BD द्वारा समर्थित किया गया था चित्रा 1 BioRender.com का उपयोग करके बनाया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% povidone-iodine Medline MDS093943
12-well plates Thermo Scientific 11889684
24-well plates VWR 734-2325
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Invitrogen D1306
96-well Stunner plate Unchained Labs 701-2025 96-well quantification plate for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples
AAVpro Titration Kit (for Real-Time PCR) Ver.2 Takara 6233 For determining the titer of AAV using RT-qPCR. This kit contains DNase I, Lysis Buffer, Dilution Buffer, positive control, Taq II mix, primer forward, primer reverse, water
Acetic acid glacial Fisher Chemical A/0360/PB17
ÄKTA pure 25 Cytiva 29018224 FPLC system controlled by UNICORN software, version 6.3 
Alkaline phosphatase-linked goat anti-mouse Invitrogen 31328
Amicon ultra-0.5 centrifugal filter unit Merck Millipore UFC5100
Amicon ultra-15 centrifugal filter unit Merck Millipore UFC9100
Benzonase Nuclease Merck Millipore E1014
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
CFX96 Real-Time PCR detection system Biorad 184-5096
ChemiDoc Touch Imaging System Bio-Rad Laboratories 1708370
Chicken polyclonal anti-GFP primary antibody Abcam ab13970
Coomassie Blue G250 Fisher Chemical C/P541/46
Dithiothreitol (DTT) Fisher Bioreagents BP17225
DMEM Sigma-Aldrich D5796
ECF Substrate for Western Blotting Cytiva RPN5785
FastDigest SmaI Thermo Scientific FD0663
FEI-Tecnai G2 Spirit Biotwin FEI Biotwin Transmission electron microscope
Fetal bovine serum Biowest S1810
Fluorescence mounting medium Dako S3023
Formvar-carbon coated 200 mesh grid  TAAB Laboratories Equipment F077/025
Gas evacuation apparatus RWD R546W
Glycerol Fisher BioReagents 10021083
Goat polyclonal anti-chicken antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11039
Hamilton needle 30G, Small Hub RN Needle, 25 mm, PST3 Hamilton 7803-07
Hamilton syringe (10 µL) Hamilton 7653-01
HEK293T American Type Culture Collection CRL-11268
HiTrap Heparin HP 1 x 5 mL Cytiva 17040701 Pre-packed heparin column
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL Cytiva 17040601 Pre-packed heparin column
Immobilon-P PVDF Membrane Merck Millipore IPVH00010
Isoflurane Braun 469860
Ketamine  Dechra Pharmaceuticals N/A Nimatek
Low-retention microcentrifuge tubes (2 mL) Fisher Scientific 11906965
Lunatic & Stunner Client software Unchained Labs N/A Client analysis software version 8.0.1.235. Software for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples
Methanol Fisher Chemical M/4000/FP21
Mouse monoclonal anti-AAV, VP1, VP2 antibody (A69) American Research Products 03-61057
Mouse monoclonal anti-AAV, VP1, VP2, VP3 antibody (B1) American Research Products 03-61058
Neuro2a American Type Culture Collection CCL-131
Normal goat serum Gibco 16210064
NucleoBond Xtra Maxi EF Macherey-Nagel 12738422
NZYColour Protein Marker II NZYtech MB09002
pAAV-CMV-scGFP Addgene 32396 Addgene plasmid # 32396; http://n2t.net/addgene:32396; RRID:Addgene_32396
pAAV-CMV-ssGFP Addgene 105530 Addgene plasmid # 105530; http://n2t.net/addgene:105530; RRID:Addgene_105530
pAAV2/9n Addgene 112865 Addgene plasmid # 112865; http://n2t.net/addgene:112865; RRID:Addgene_112865
Paraformaldehyde Acros Organics 10342243
PBS Fisher BioReagents BP2438
Penicillin-streptomycin Gibco 15140-122
Pluronic F-68 Non-ionic Surfactant (100x) Gibco 24040032
Polyethylenimine MAX, MW 40,000 Polysciences Europe 24765
R500 Series Compact Small Animal Anesthesia Machine - Isoflurane RWD N/A
Sample Inlet Valve V9-IS Cytiva 29027746
Sample pump P9-S Cytiva 29027745
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Sodium chloride Fisher Scientific 10428420
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher Bioreagents BP166
Sterile PVDF syringe filter Fisher Scientific 15191499
Stunner Platform Unchained Labs 700-2002 Equipment for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples
Superloop 150 mL Cytiva 18-1023-85
Superloop 50 mL Cytiva 18-1113-82
SURE 2 supercompetent cells Stratagene, Agilent Technologies HPA200152
Treated culture dishes Corning 734-1711
Tris base Fisher BioReagents BP152
Tris hydrochloride Fisher BioReagents BP153
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Trypsin-EDTA Gibco 25200-072
Wheat Germ Agglutinin (WGA) conjugated with Alexa Fluor 633 Invitrogen W21404
Xylazine Dechra Pharmaceuticals N/A Sedaxylan
Zeiss Axio Observer Z1 Carl Zeiss Microscopy GmbH N/A Inverted fluorescence microscope equiped with an EC Plan-Neofluar 10x/0.30 objective and a Plan-Apochromat 40x/0.95 objective
Zeiss Axio Scan.Z1 Carl Zeiss Microscopy GmbH N/A Slide scanner fluorescence microscope equipped with a Plan-Apochromat 20x/0.8 objective
Zeiss LSM 710 Carl Zeiss Microscopy GmbH N/A Inverted confocal microscope equipped with a Plan-Apochromat 40x/1.4 Oil DIC objective
µ-Slide 8 well Ibidi Ibidi 80826 8-well chamber slide

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 206
एकल-चरण और अर्ध-स्वचालित हेपरिन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी प्रोटोकॉल के माध्यम से एडेनो-जुड़े वायरल वैक्टर का अलगाव
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