Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Isolering av adenoassocierade virala vektorer genom ett enstegs och halvautomatiskt heparinaffinitetskromatografiprotokoll

Published: April 5, 2024 doi: 10.3791/66550
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 1,2,4, 1,2,5, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3,6, *1,2,4,5, *1,2,3,4
1CNC-UC - Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 2CIBB - Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology, University of Coimbra, 3IIIUC - Institute for Interdisciplinary Research, University of Coimbra, 4ViraVector - Viral Vectors for Gene Transfer Core Facility, University of Coimbra, 5FFUC - Faculty of Pharmacy, University of Coimbra, 6MICC-CNC - Microscopy Imaging Center of Coimbra - CNC, University of Coimbra
* These authors contributed equally

Summary

Detta manuskript beskriver ett detaljerat protokoll för generering och rening av adeno-associerade virala vektorer med hjälp av en optimerad heparinbaserad affinitetskromatografimetod. Det presenterar ett enkelt, skalbart och kostnadseffektivt tillvägagångssätt, vilket eliminerar behovet av ultracentrifugering. De resulterande vektorerna uppvisar hög renhet och biologisk aktivitet, vilket bevisar deras värde i prekliniska studier.

Abstract

Adeno-associerat virus (AAV) har blivit en allt mer värdefull vektor för in vivo genleverans och genomgår för närvarande kliniska prövningar på människor. De vanligaste metoderna för att rena AAV:er använder sig dock av ultracentrifugering med cesiumklorid eller jodixanoldensitetsgradient. Trots sina fördelar är dessa metoder tidskrävande, har begränsad skalbarhet och resulterar ofta i vektorer med låg renhet. För att övervinna dessa begränsningar riktar forskare sin uppmärksamhet mot kromatografitekniker. Här presenterar vi ett optimerat heparinbaserat affinitetskromatografiprotokoll som fungerar som ett universellt infångningssteg för rening av AAV.

Denna metod bygger på den inneboende affiniteten hos AAV-serotyp 2 (AAV2) för heparansulfatproteoglykaner. Specifikt innebär protokollet samtransfektion av plasmider som kodar för de önskade AAV-kapsidproteinerna med de från AAV2, vilket ger mosaik-AAV-vektorer som kombinerar egenskaperna hos båda föräldrarserotyperna. Kortfattat, efter lys av producentceller, renas en blandning som innehåller AAV-partiklar direkt efter ett optimerat enstegs heparinaffinitetskromatografiprotokoll med hjälp av ett standardsystem för snabb proteinvätskekromatografi (FPLC). Renade AAV-partiklar koncentreras därefter och utsätts för omfattande karakterisering med avseende på renhet och biologisk aktivitet. Detta protokoll erbjuder ett förenklat och skalbart tillvägagångssätt som kan utföras utan behov av ultracentrifugering och gradienter, vilket ger rena och höga virala titrar.

Introduction

Adeno-associerade virus (AAV) är på väg att erövra sin väg som ett av de mest lovande leveranssystemen i nuvarande genterapistudier. AAV, som ursprungligen identifierades 19651, är ett litet, icke-höljeförsett virus, med en ikosaedrisk proteinkapsid på cirka 25 nm i diameter, som innehåller ett enkelsträngat DNA-genom. AAVs tillhör familjen Parvoviridae och släktet Dependoparvovirus på grund av deras unika beroende av samtidig infektion med ett hjälparvirus, såsom herpes simplexvirus eller, mer ofta, adenovirus, för att fullborda sin lytiska cykel 2,3.

Det 4,7 kilobasiska genomet hos AAV:er består av två öppna läsramar (ORF) flankerade av två inverterade terminalupprepningar (ITR) som bildar karakteristiska T-formade hårnålsändar4. ITR:er är de enda cis-verkande elementen som är kritiska för AAV-paketering, replikering och integration, och är därför de enda AAV-sekvenser som behålls i rekombinanta AAV-vektorer (rAAV). I detta system tillförs de gener som är nödvändiga för vektorproduktion separat, in trans, vilket gör att genen av intresse kan förpackas inuti virusets kapsid 5,6.

Varje viral gen kodifierar olika proteiner genom alternativ splitsning och startkodon. Inom Rep ORF kodas fyra icke-strukturella proteiner (Rep40, Rep52, Rep68 och Rep78) och spelar avgörande roller i replikation, platsspecifik integration och inkapsling av viralt DNA 7,8. Cap ORF fungerar som en mall för uttrycket av tre strukturella proteiner som skiljer sig från varandra vid deras N-terminal, (VP1, VP2 och VP3), som samlas för att bilda en 60-mer viral kapsid i förhållandet 1:1:10 4,9. Dessutom kodar en alternativ ORF som är inbäddad i Cap-genen med ett icke-konventionellt CUG-startkodon för ett monteringsaktiverande protein (AAP). Detta kärnprotein har visat sig interagera med de nyligen syntetiserade kapsidproteinerna VP1-3 och främja kapsidsammansättning10,11.

Skillnader i aminosyrasekvensen i kapsiden står för de 11 naturligt förekommande AAV-serotyperna och över 100 varianter isolerade från människor och icke-mänskliga primatvävnader 7,12,13. Variationer i konformationen av strukturellt variabla regioner styr de distinkta antigena egenskaperna och receptorbindande specificiteterna hos kapsider från olika stammar. Detta resulterar i distinkta vävnadstrosmer och transduktionseffektivitet över olika däggdjursorgan14.

Tidiga produktionsmetoder för rAAVs förlitade sig på adenovirusinfektion för hjälpändamål 15,16,17,18,19. Trots att infektionen är effektiv och vanligtvis lätt att producera i stor skala uppstår flera problem med den. Även efter rening och ett värmedenatureringssteg för inaktivering kan adenovirala partiklar fortfarande finnas kvar i AAV-preparat, vilket utgör en oönskad säkerhetsrisk20. Dessutom är förekomsten av denaturerade adenovirala proteiner oacceptabel för klinisk användning. Andra produktionsstrategier drar nytta av rekombinanta herpes simplex-virusstammar som är konstruerade för att föra Rep/Cap och transgenen in i målcellerna21 eller i baculovirus-insektscellsystemet22. Även om dessa system erbjuder fördelar när det gäller skalbarhet och GMP-kompatibilitet, står de fortfarande inför liknande problem.

Den tredubbla transfektionsmetoden för rAAV-produktion har ofta antagits för att enkelt övervinna dessa problem. Kortfattat bygger rAAV-sammansättningen på den transienta transfektionen av celler med tre plasmider som kodar för: 1) den transgenuttryckskassett som är packad mellan ITR:erna från vildtypens AAV2-genomet (pITR); 2) de Rep/Cap-sekvenser som krävs för replikation och virionmontering (pAAV-RC); och 3) de minimala adenovirala proteinerna (E1A, E1B, E4 och E2A) tillsammans med de adenovirusassocierade RNA som krävs för hjälpareffekten (pHelper)6,20,23. Medan plasmidtransfektionsmetoder ger enkelhet och flexibilitet för rAAV-produktion i prekliniska studier, har dessa procedurer begränsningar när det gäller skalbarhet och reproducerbarhet när de tillämpas på storskalig produktion. Som ett alternativt tillvägagångssätt kan rAAV-produktion uppnås genom användning av AAV-producentcellinjer (av både vidhäftande och suspensionstillväxt), som stabilt uttrycker antingen AAV Rep/Cap-gener eller Rep/Cap i kombination med vektorkonstruktioner. I dessa system introduceras de adenovirala hjälpargenerna genom plasmidtransfektion. Även om denna strategi förbättrar skalbarheten i cellodlingsprocessen är den tekniskt komplex och tidskrävande 21,24,25.

I båda fallen lyseras sedan producentcellerna och utsätts för ett eller flera reningssteg. För närvarande inkluderar de huvudsakliga metoderna för rening av rAAVs användning av cesiumklorid (CsCl) eller jodixanol ultrahöghastighets densitetsgradientcentrifugering följd, eller inte, av kromatografitekniker26. Det ursprungliga reningsschemat för viral utfällning använde ammoniumsulfat, följt av två eller tre omgångar av ultracentrifugering genom en CsCl-gradient. De främsta fördelarna med denna process inkluderar möjligheten att rena alla serotyper och förmågan att fysiskt separera hela partiklar från tomma kapsider baserat på deras olika densiteter. Denna metod är dock genomarbetad, tidskrävande och har begränsad skalbarhet, vilket ofta resulterar i dålig avkastning och låg provkvalitet 27,28,29,30. Dessutom är dialys mot en fysiologisk buffert ofta nödvändig före in vivo-studier på grund av de toxiska effekter som CsCl kan utöva på däggdjur.

Jodixanol har också använts som ett alternativt iso-osmotiskt gradientmedium för att rena rAAV-vektorer, med fördelar jämfört med CsCl ur både säkerhets- och vektorpotenssynpunkt. Liksom CsCl uppvisar dock jodixanolmetoden vissa nackdelar relaterade till laddningskapaciteten hos cellodlingslysat (och därmed skalbarheten av rAAV-rening) och det är fortfarande en tidskrävande och dyr metod30,31.

För att övervinna dessa begränsningar vände forskare sin uppmärksamhet mot kromatografitekniker. I detta avseende utvecklades flera reningsmetoder som antingen innehåller affinitets-, hydrofoba eller jonbyteskromatografimetoder. Dessa metoder är beroende av de biokemiska egenskaperna hos en viss serotyp, inklusive deras naturliga receptorer, eller laddningsegenskaperna hos viruspartikeln32. Till exempel öppnade upptäckten att AAV2, AAV3, AAV6 och AAV13 företrädesvis binder till heparansulfatproteoglykaner (HSPG), möjligheten att använda det närbesläktade heparinet vid rening av affinitetskromatografi. Bindningsställena till HSPG kan dock skilja sig åt mellan serotyper, vilket medierar AAV-bindning och infektion av målceller på olika sätt 2,33,34,35,36. Å andra sidan binder AAV1, AAV5 och AAV6 till N-kopplad sialinsyra (SA), medan AAV4 använder O-kopplad SA 2,14,34. I enlighet med samma logik har ett enstegs affinitetskromatografiprotokoll för rening av rAAV5 också utvecklats baserat på användning av mucin, ett däggdjursprotein som är starkt anrikat i SA37. Liksom heparinbaserade tekniker är denna rening också beroende av den specifika serotyp som genereras. Förutom heparin och mucin har andra ligander utforskats för affinitetskromatografi, såsom den monoklonala A20-antikroppen och camelid single-domain antikroppar (AVB Sepharose och POROS CaptureSelect)22,23,38,39,40,41. Andra innovativa strategier för att förbättra de tidigare existerande reningsmetoderna involverar införandet av små modifieringar i rAAV-kapsiden för att presentera specifika bindande epitoper. Till exempel kan hexa-histidin-märkta eller biotinylerade rAAVs renas med hjälp av ligander som riktar sig mot dessa epitoper (nickelnitrilotriättiksyra respektive avidinhartser)42,43,44.

I ett försök att bredda de önskade egenskaperna hos rAAVs har forskare crossdressat virionerna genom att blanda deras kapsider. Detta åstadkoms genom att kapsidgenen tillförs från två distinkta AAV-serotyper i ekvimolära eller olika förhållanden under produktionen, vilket ger upphov till en kapsidstruktur som består av en blandning av kapsidunderenheter från olika serotyper 34,45,46,47,48,49,50. Tidigare studier ger fysiska bevis för att samuttryckande kapsidproteiner från AAV2 med AAV1 (1:1-förhållande) och AAV2 med AAV9 (1:1-förhållande) resulterar i generering av mosaikvektorer rAAV1/2 och rAAV2/9, respektive 45,46,48. En stor fördel med genereringen av mosaik-rAAVs är förmågan att integrera fördelaktiga egenskaper från olika AAV-serotyper, vilket resulterar i synergistiska förbättringar i transgenuttryck och tropism, samtidigt som andra egenskaper som är användbara under rAAV-produktion bibehålls. Intressant nog uppvisar vissa mosaikvarianter till och med nya egenskaper som skiljer sig från båda föräldravirusen 46,47,49. Genom att dra nytta av den heparinbindande förmågan hos AAV2 kan mosaik-rAAV-vektorer potentiellt genereras och renas genom att blanda AAV2 med andra naturliga eller nya AAV-kapsider som genereras genom riktad evolution och/eller rationell design. Icke desto mindre har tidigare studier belyst vikten av kompatibilitet med kapsidsubenheter när man försöker sätta ihop mosaikvektorer. Till exempel visade Rabinowitz och kollegor att även om transkapsidationen av AAV1, AAV2 och AAV3 ledde till en effektiv sammontering av mosaikkapsider, hindrade korsdressingen av dessa serotyper med AAV4 genereringen av stabila virioner 34,45,47. Dessutom visade AAV1, AAV2 och AAV3 låg kompatibilitet med AAV5, med tanke på de minskade virala titrar som erhölls vid blandning av dessa kapsider i olika förhållanden. Intressant nog visade mosaik rAAV2/5 minskade heparinbindande egenskaper, samtidigt som den bibehöll mucinbindande förmågan som föräldrarnas AAV5. Emellertid bevarade rAAV3/5 i förhållandet 3:1 den dubbla bindningen till heparin och mucin. Sammantaget kan genereringen av nya mosaik-rAAVs med förbättrad transduktion, specifik tropism eller låg immunogenicitet dra stor nytta av vår förståelse av kapsidmontering och receptorinteraktioner, med specifika kombinationer som fortfarande kräver noggrann undersökning och optimering.

I detta arbete beskriver vi ett steg-för-steg-protokoll för produktion och rening av rAAVs med hjälp av en optimerad heparinaffinitetskromatografimetod. rAAVs produceras genom transient transfektion och renas med hjälp av ett system med snabb proteinvätskekromatografi (FPLC). Efter koncentrationen av utvalda renade fraktioner karakteriseras de resulterande virusstammarna i termer av titer, renhet, inneboende fysikaliska egenskaper och biologisk aktivitet in vitro och in vivo. Som ett bevis på konceptet demonstrerar vi förbättringarna och tillämpligheten av detta protokoll för generering av mosaik rAAV1/2 och rAAV2/9 vektorer. Valet av varje serotyp baserades på deras slående olika tropismer, vilket kan ge deras unika egenskaper även till mosaikversionerna. AAV-serotyp 1, med en övergripande måttlig tropism för det centrala nervsystemet (CNS), har förmågan att transducera neuroner och glia (i mindre utsträckning) och genomgår axonal transport i anterograd och retrograd riktning in vivo 2,7,8. Dessutom valdes AAV serotyp 9 för sin naturliga förmåga att passera blod-hjärnbarriären och rikta in sig på CNS hos både neonatala och vuxna möss51,52. Slutligen valdes AAV serotyp 2 på grund av dess förmåga att binda till heparin, vilket möjliggör affinitetskromatografi33. De renade rAAV1/2- och rAAV2/9-partiklarna kombinerar egenskaperna hos båda föräldrarnas AAV-serotyper och utgör därför lämpliga vektorer för transduktion av CNS 45,46,48,49.

Protocol

OBS: Se figur 1 för en illustration som sammanfattar protokollet. Se materialtabellen för detaljer om alla material, instrument och reagenser som används i detta protokoll. Allt arbete som involverar celler och virus bör utföras i särskilda biosäkerhetsskåp och inkubatorer, åtskilda från dem som regelbundet används för underhåll av cellinjer. Utrustning och reagenser som kommer i kontakt med odlade celler och virus bör vara sterila. Det är viktigt att bortskaffandet av farliga reagenser och material som är kontaminerade med virus utförs i enlighet med säkerhetsdatabladen och i enlighet med nationella lagar och riktlinjer som tillhandahålls av varje institutions miljö- och hälsoskyddskontor. Från och med april 2019 kategoriserar NIH:s riktlinjer för forskning som involverar rekombinanta eller syntetiska nukleinsyramolekyler alla AAV-serotyper, såväl som rekombinanta eller syntetiska AAV-konstruktioner, som riskgrupp 1-medel (inte förknippade med sjukdom hos friska vuxna människor). Denna klassificering gäller när transgenen inte kodar för en potentiellt tumörframkallande genprodukt eller ett toxin, och konstrukten produceras utan ett hjälparvirus.

Alla djurförsök utfördes i enlighet med EU:s gemenskapsdirektiv (2010/63/EU) om vård och användning av försöksdjur, som införlivades i den portugisiska lagen 2013 (lagdekret 113/2013). Dessutom godkändes djurprocedurer av den ansvariga organisationen för djurvälfärd vid medicinska fakulteten och Center for Neuroscience and Cell Biology vid University of Coimbras licensierade djuranläggning. Forskarna fick adekvat utbildning (FELASA-certifierad kurs) och certifiering från de portugisiska myndigheterna (Direcção Geral de Alimentação e Veterinária, Lissabon, Portugal) för att kunna utföra experimenten.

1. Plasmidkonstruktioner

  1. Följ tillverkarens instruktioner för ett maxiprep endotoxinfritt kit för att isolera och rena betydande DNA-mängder av följande plasmider: i) pITR: överföringsvektorn av intresse; ii) pAAV-RC-plasmid: pRV1, innehållande AAV2 Rep - och Cap-sekvenserna 36; iii) pAAV-RC-plasmid: pH21, innehållande AAV1 Rep - och Cap-sekvenserna 36; iv) pAAV-RC-plasmid: pAAV2/9n, innehållande sekvenserna AAV2 Rep och AAV9 Cap ; v) pHjälpare: pFdelta6, Adenovirus-hjälparplasmid36.
  2. Undersök integriteten hos de genererade plasmiderna genom att utföra de rekommenderade enzymatiska restriktionerna36. Övervaka integriteten hos pITR-plasmider genom nedbrytning med SmaI, en restriktionsendonukleas, som skär två gånger inom en instabil del av ITR53,54.
    OBS: Eftersom ITR är mycket instabila och känsliga för deletioner rekommenderas användning av SURE 2 superkompetenta celler för att minimera rekombination på dessa platser.

2. Cellodling

  1. Odling av human embryonal njure 293, som stabilt uttrycker cellinjen SV40 large T antigen (HEK293T) i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) höga glukoshalt, kompletterat med 10 % fetalt bovint serum och 1 % penicillin-streptomycin, vid 37 °C, under en fuktad atmosfär innehållande 5 % CO2, som utgångspunkt för efterföljande steg.
  2. Subkulturera cellerna med steril 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS), pH 7,4, för att tvätta cellerna innan 0,05 % trypsin-etylendiamintetraättiksyra (EDTA) tillsätts.
    OBS: Undvik att använda celler som har genomgått ett för stort antal passager (max 20). Testa regelbundet cellkulturer för mykoplasmakontaminering.

3. Produktion av rAAV genom transient transfektion

  1. Dag 1: Cellplätering
    1. För varje virusproduktion, platta HEK293T celler i 10 behandlade odlingsskålar (15 cm diameter) dagen före transfektion, med en densitet av 10,5 × 106 celler per maträtt i 22 ml tillskottsbaserat odlingsmedium och inkubera i 24 timmar tills cellerna är 70-80 % sammanflytande och redo för transfektion.
  2. Dag 2: Celltransfektion med polyetylenimin (PEI)
    1. För varje virusproduktion (motsvarande 10,5 rätter), ställ in följande transfektionsblandning i ett mikrocentrifugrör: 54,6 μg pITR; 45,675 μg pRV1; 45,675 μg pH21 eller pAAV2/9n; 109,2 μg pFdelta6. Blanda genom att knacka.
    2. Tillsätt blandningen till 4,557 ml icke-tillsatt DMEM i ett 50 ml centrifugrör. Blanda genom att knacka.
    3. Tillsätt 1,365 ml steril PEI-lösning med 1 mg/ml (pH 7,4), droppe för droppe. Blanda genom att knacka. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur för att tillåta bildning av DNA-PEI-komplex.
    4. Tillsätt denna blandning till 231 ml förvärmd tillförfylld DMEM. Byt ut hela odlingsmediet för varje maträtt mot 22 ml av denna transfektionsblandning. Inkubera cellerna i 48 timmar.
      OBS: Detta steg måste utföras med försiktighet för att undvika cellavlossning.
  3. Dag 4: Cellskörd
    1. När pITR kodar för en fluorescerande reporter, visualisera de transfekterade cellerna under ett fluorescensmikroskop.
    2. Samla upp mediet från varje skål i 50 ml centrifugrör och centrifugera dem vid 800 × g i 10 minuter. Kassera supernatanten.
      OBS: Detta steg är valfritt och syftar till att återställa transfekterade celler som kan ha lossnat på grund av ett mycket högt sammanflöde.
    3. Tillsätt 10 ml förvärmd PBS till varje platta. Ta försiktigt bort cellerna med en cellskrapa och samla upp suspensionen i 50 ml centrifugrören från steg 3.3.2.
    4. Diska 5 rätter åt gången med ytterligare 10 ml PBS och överför suspensionen till 50 ml centrifugrören från och med steg 3.3.3. Pelletera cellerna vid 800 × g i 10 minuter och kassera supernatanten.
    5. Cellpelletsen fryses vid -80 °C.
      OBS: Cellpellets kan lagras i flera månader (pauspunkt).

4. rAAV-extraktion och FPLC-rening

  1. Dag 5: Förberedelse av celllysat
    1. Tina cellpelletsen i rumstemperatur. Återsuspendera cellerna som samlats in från de 10 skålarna i 100 ml steril buffert innehållande 150 mM natriumklorid (NaCl) och 20 mM Tris, pH 8,0, i ultrarent (typ I) vatten. Blanda suspensionen genom att pipettera upp och ner för att säkerställa en homogen suspension.
    2. Tillsätt 12,5 ml av en nyberedd steril lösning av 10 % natriumdeoxikolat i ultrarent vatten för att inducera celllys. Blanda genom att pipettera upp och ner.
      OBS: Kassera natriumdeoxikolat, såväl som material som kommer i kontakt med det, i enlighet med materialsäkerhetsdatabladet och riktlinjerna från institutionens miljö- och hälsoskyddskontor. Det rekommenderas också att bära en ansiktsmask när du hanterar detta pulver. Efter blandning blir lösningen mycket viskös.
    3. Tillsätt 27 μl bensonasnukleas till den föregående blandningen. Blanda ordentligt genom att pipettera upp och ner tills provet inte längre är trögflytande. Inkubera vid 37 °C i 1 timme, utför en virvel var 10:e minut.
      OBS: Detta endonukleas kan effektivt bryta ned alla former av DNA och RNA utan att uppvisa någon proteolytisk aktivitet.
    4. Avlägsna cellulärt skräp genom att centrifugera blandningen vid 3 000 × g i 60 minuter vid 25 °C. Filtrera supernatanten med ett 0,45 μm sterilt sprutfilter av polyvinylidendifluorid (PVDF) och överför det till en ny steril behållare.
      OBS: Detta viktiga steg säkerställer att det mesta av det cellulära skräpet avlägsnas, vilket förhindrar igensättning av kromatografikolonner. Spara en liten delmängd av denna blandning för analys (valfritt steg).
  2. Dag 5 (fortsättning): Rening av heparinkolonn av rAAVs
    OBS: Sample applicering kan utföras med hjälp av en sample pump eller en 50 ml eller 150 mL superloop som en del av systemet. Eftersom mer luft löses upp vid lägre temperaturer är det viktigt att ge tillräckligt med tid för buffertarna och lösningarna (vanligtvis förvarade vid 4 °C) att acklimatisera sig till rumstemperatur innan de används i FPLC-systemet.
    1. Valfritt: Om systemet har lagrats under långa perioder, fyll systemet och alla inlopp med nyberedd lagringslösning (20 % etanol) med hjälp av manuella instruktioner eller en fördefinierad metod för systemrengöring på plats (system CIP).
    2. Tvätta vätskeflödesvägen fullständigt med sterilt ultrarent vatten med hjälp av manuella instruktioner eller en fördefinierad CIP-systemmetod.
    3. Anslut en 1 ml färdigpackad heparinkolonn, ställ in trycklarmet och tvätta med fem kolonnvolymer (CV) ultrarent vatten med en flödeshastighet på 1 ml/min.
    4. Byt lösningarna i buffertbrickan från ultrarent vatten till buffert A (steril lösning av 100 mM NaCl och 20 mM Tris, pH 8, i ultrarent vatten) för inlopp A (systempump A) och till buffert B (steril lösning av 500 mM NaCl och 20 mM Tris, pH 8, i ultrarent vatten) för inlopp B (systempump B). Om systemet har en provpump, placera buffertinloppet till provinloppsventilen i buffert A.
    5. Tvätta systempumpen B med buffert B och fyll resten av vätskeflödesvägen med buffert A.
      OBS: Koppla vid behov bort kolonnen från flödesvägen och anslut den igen efteråt.
    6. Sätt in en provinloppsslang från provets inloppsventil, t.ex.ample, S1, i behållaren med det virala preparatet som erhölls i steg 4.1.4. (från beredning av celllysat). Fyll flödesvägen från provinloppet S1 till insprutningsventilen med provlösningen. Alternativt kan du fylla en 50 ml eller 150 ml superloop med sample som innehåller rAAVs med hjälp av en 50 ml spruta.
    7. Jämvikt kolonnen med en total volym av fem CV med användning av 12,5 % av buffert B med en hastighet av 1 ml/min.
    8. Applicera den totala volymen av provet i kolonnen med hjälp av provpumpen (välj injicera allt prov med luftsensorn) eller superloop vid 0.5 ml/min och samla upp genomströmningen med hjälp av utloppsporten i en ny steril behållare.
      OBS: När flödeskontrollen för att förhindra övertrycksfunktionen är aktiverad kommer flödet automatiskt att minska i händelse av igensättning av kolonnen. Om flödeshastigheten sjunker betydligt under 0.5 ml/min, stoppa provapplikationen, utför en tvätt med 2-5 CV buffert A och återuppta sedan provapplikationen.
    9. Tvätta kolonnen vid 1 ml/min med 20 CV buffert A, samla upp genomströmningen med hjälp av utloppsporten.
    10. Eluera provet vid 1 ml/min enligt följande schema: i) linjär gradient med ett mål på 50 % av buffert B för fem CVs; ii) gå med ett mål på 90 % av buffert B under fem CV; iii) stega med ett mål på 100 % av buffert B under fem CV.
    11. Samla upp det eluerade provet i fraktioner av 1 ml med hjälp av en fraktionsuppsamlare och mikrocentrifugrör med låg retention (2 ml) och förvara dem vid -20 °C.
      OBS: rAAV-fraktionerna kan lagras i flera veckor (pauspunkt).
    12. Åter jämvikt kolonnen vid 1 ml/min med 12,5 % av buffert B för fem CV.
    13. Byt inlopp från buffertlösningarna till ultrarent vatten och tvätta kolonnen med 1 ml/min i fem CV.
    14. Byt inloppen från ultrarent vatten till 20 % etanol och tvätta kolonnen med 1 ml/min i fem CV. Koppla bort kolonnen och förvara den vid 4 °C.
      OBS: Kolonner kan återanvändas flera gånger utan några andra större rengörings- och saneringsprocedurer om samma rAAV-serotyp och transgen används.
    15. Tvätta vätskeflödesvägen helt med 20 % etanol med hjälp av manuella instruktioner eller en fördefinierad CIP-metod för systemet.

5. Koncentration av renade rAAVs

  1. Dag 6: Koncentration steg 1
    1. Koncentra rAAVs med hjälp av en 15 ml centrifugalfilterenhet med en 100 kDa molekylviktsgräns. Fyll på önskade fraktioner som innehåller rAAVs (FPLC-fraktioner 7 till 16) i 15 ml centrifugalfilterenheten och centrifugera den vid 2 000 × g i 2 minuter vid rumstemperatur. Se till att den koncentrerade volymen i filterenheten är cirka 500 μL. Om den koncentrerade volymen till stor del överstiger 500 μL, upprepa centrifugeringsstegen med 1 minuts intervall tills den når önskad volym.
  2. Dag 6 (fortsättning): Buffertbyte
    1. Tillsätt 1 ml steril PBS till centrifugalfilterenheten som innehåller rAAVs. Pipettera försiktigt upp och ner för att tvätta filtret. Centrifugera vid 2 000 × g med 1 minuts intervall tills den slutliga volymen på 500 μL uppnås.
  3. Dag 6 (fortsättning): Koncentration steg 2
    1. Överför de 500 μl koncentrerade rAAVs som erhölls i föregående steg till en 0,5 ml centrifugalfilterenhet med en cutoff på 100 kDa molekylvikt och centrifugera vid 6 000 × g i 1 minut. Upprepa vid behov centrifugeringssteget tills en slutlig volym på mindre än 100 μL uppnås.
  4. Dag 6 (fortsättning): Återhämtning
    1. För att återvinna den koncentrerade rAAV, placera filteranordningen upp och ner i ett nytt uppsamlingsrör för mikrocentrifuger. Placera röret i en mikrocentrifug med locket mot mitten och utför en långvarig snurrning inuti flödeskammaren för att överföra koncentrerade rAAVs från enheten till mikrocentrifugröret. Alternativt kan du centrifugera vid 1 000 × g i 2 minuter.
    2. Komplettera med steril Pluronic F-68 0,001% (valfritt).
      OBS: Pluronic F-68 är ett nonjoniskt ytaktivt ämne som är godkänt för humant bruk av Food and Drug Administration och som kan mildra förluster av rAAVs genom att förhindra deras interaktioner med ytorna på material (plast) som används under utspädningsberedning, sprutladdning och leveransutrustning55,56.
    3. Alikvot rAAVs i mikrocentrifugrör med låg retention och förvaras vid -80 °C (pauspunkt).

6. Kvantifiering av renade rAAVs

  1. Dag 6 (fortsättning): Bestäm titern för rAAV-preparat, uttryckt i virala genom/μL (vg/μL), genom kvantitativ polymeraskedjereaktion i realtid (RT-qPCR) med hjälp av ett kommersiellt kit och enligt tillverkarens instruktioner.
    1. Inkubera rAAV-partikellösningen med DNas I vid 37 °C i 20 minuter.
      OBS: Denna procedur främjar nedbrytningen av fritt genomiskt DNA och plasmid-DNA som härrör från värdceller, vilket säkerställer att endast nukleinsyrasekvensen inuti intakta rAAV-partiklar bevaras.
    2. Värmeinaktiverar DNase I vid 95 °C i 10 min.
    3. Tillsätt Lysis Buffer och inkubera i 10 minuter vid 70 °C för att främja värmedenaturering av proteinerna i rAAV-partiklar.
    4. Späd den erhållna rAAV-genomlösningen i utspädningsbuffert innan du går vidare till RT-qPCR. Förbered en uppsättning seriellt utspädda standarder för den positiva kontrollen (från 2 × 107 vg/μL till 2 × 102 vg/μL) som medföljer satsen.
    5. Utför en reaktionsblandning som innehåller 12,5 μL Taq II-blandning, 0,5 μL utspädd primerblandning, 7 μL vatten och 5 μL utspätt rAAV-DNA (okänt AAV-prov och standarder från steg 6.1.4.).
    6. Utför RT-qPCR i ett PCR-detektionssystem i realtid med hjälp av följande protokoll: 1 cykel vid 95 °C i 2 minuter (initial denaturering) och 40 cykler vid 95 °C i 5 s (denaturering) och 60 °C i 30 s (glödgning, förlängning och plattavläsning), följt av en smältkurvaanalys.
    7. Beräkna den absoluta provkoncentrationen med hjälp av standardkurvan (linjär regressionslinje), med beaktande av den utspädningsfaktor som blir resultatet av beredningen av rAAV-provet.
      OBS: Kvantifieringen av antalet virala genom uppnås genom amplifiering av ITR-sekvensen av AAV2 (målsekvensen för de primers som tillhandahålls av satsen).

7. SDS-PAGE, Coomassie blå färgning och western blot

  1. Denaturera 40 μl av varje prov (varje FPLC-fraktion, genomflödet, förkolonnproverna och totalt 2,3 × 1010 vg av den slutliga koncentrerade produkten) genom tillsats av 6 x provbuffert (0,5 M Tris-HCl/0,4 % natriumdodecylsulfat (SDS) pH 6,8, 30 % glycerol, 10 % SDS, 0,6 M ditiotreitol (DTT), 0,012 % bromfenolblått) och inkubation av proverna i 5 minuter vid 95 °C.
  2. Ladda de denaturerade proverna (48 μL) i en SDS-polyakrylamidgel (4 % staplingsgel och 10 % upplösande gel) och utför elektroforetisk separation vid 100 V i 70 minuter, i anslutning till en proteinstege.
  3. Analys av protein
    OBS: Antingen Coomassie blå färgning eller western blotting kan utföras.
    1. Coomassie blå färgning
      1. För att visualisera proteinband, färga gelen i 10 minuter med en 0,25 % Coomassie blå G250-lösning upplöst i 50 % metanol och 10 % ättiksyra glacial.
      2. Utför gelavfärgning genom att tvätta den flera gånger med en lösning som innehåller 25 % metanol och 5 % ättiksyra glacial tills tydliga band med låg bakgrund blir synliga.
      3. Ta bilder med ett lämpligt bildsystem.
    2. Västra blotet
      1. Överför proteinerna till ett PVDF-membran enligt standardprotokoll.
      2. Blockera membranet genom inkubation i 5 % fettfri mjölk utspädd i TBS-T (0,1 % Tween 20 i Tris-buffrad koksaltlösning) i 1 timme vid rumstemperatur.
      3. Använd följande primära antikroppar (utspädda i blockerande lösning) för inkubation över natten vid 4 °C: mus monoklonal anti-AAV, VP1, VP2, VP3 antikropp (B1, 1:1 000) eller mus monoklonal anti-AAV, VP1, VP2 antikropp (A69, 1:1 000).
      4. Tvätta hinnorna i 3 x 15 minuter i TBS-T och inkubera med en alkalisk fosfatasbunden get-anti-mus-sekundär antikropp (1:10 000), i 2 timmar vid rumstemperatur.
      5. Tvätta hinnorna i 3 x 15 minuter i TBS-T. Tillsätt förstärkt kemifluorescenssubstrat (ECF) och visualisera proteinband genom kemifluorescensavbildning.

8. Transmissionselektronmikroskopi (TEM)

  1. Placera ett Formvar-kolbelagt 200 mesh-galler upp och ner ovanpå en droppe av ett rAAV-prov och låt det sätta sig i 1 min.
  2. Tvätta gallren i en droppe vatten och torka det flytande överskottet med filterpapper.
  3. Färga gallren negativt med 1 % uranylacetatlösning (pH 7) i 1 minut för att fixera och kontrastera de virala partiklarna.
  4. Tvätta gallren i en droppe vatten och torka det flytande överskottet med filterpapper.
  5. Undersök proverna i ett transmissionselektronmikroskop.
    OBS: Höga saltkoncentrationer kan direkt påverka bindningen av rAAVs till rutnätet och leda till visualisering av kristallliknande strukturer.

9. Konsekutiv absorption av ultraviolett synligt ljus, statisk ljusspridning och dynamisk ljusspridningsanalys

  1. På en 96-brunnars kvantifieringsplatta, fyll på 2 μL av ett rAAV-prov och 2 μL PBS som ska användas som buffertblank (utför detta i duplikat).
  2. Använd AAV Quant-applikationen i klientanalysprogrammet, placera namnen på proverna på rätt plats på plattan, välj AAV-serotypen och klicka på Nästa.
  3. Ladda 96-brunnars kvantifieringsplattan i den dedikerade utrustningen och fortsätt med plattavläsning för datainsamling.

10. Tester för transduktion in vitro

  1. Olika cellinjer kan användas för att snabbt analysera transduktionseffektiviteten hos rAAVs.
    1. Frö jämnt HEK293T celler i 24-brunnars plattor (med en densitet av 137 500 celler/brunn) och en musneuroblastom-2A (Neuro2a) cellinje i antingen 24-brunnars plattor (50 000 celler/brunn) eller i ett 8-brunnars kammarglas (27 000 celler/brunn), med användning av DMEM högt glukos, kompletterat med 10 % fetalt bovint serum och 1 % penicillin-streptomycin, som beskrivits ovan. Låt cellerna fästa över natten vid 37 °C i en fuktad atmosfär som innehåller 5 % CO2 .
    2. Samla upp konditionerat medium från varje brunn (250 μL från plattor med 24 brunnar och 50 μL från objektglaset med 8 brunnar) och förvara det vid 4 °C för senare användning.
    3. Tillsätt följande rAAV-preparat till varje brunn och inkubera cellerna i 24 timmar vid 37 °C i en 5 % CO2 atmosfär.
      1. Tillsätt 50 μl av de FPLC-insamlade fraktionerna F2-F16 och genomflöde för att HEK293T celler som är överförda i plattor med 24 brunnar.
      2. Tillsätt totalt 5,5 × 109 vg av de koncentrerade rAAVs utspädda i 50 μL PBS till Neuro2a-celler pläterade i 24-hålsplattor (inkludera en negativ kontrollbrunn genom att tillsätta 50 μL PBS till cellerna).
      3. Tillsätt totalt 2,75 × 109 vg av de koncentrerade rAAVs utspädda i 25 μL PBS till Neuro2a-celler pläterade i ett 8-håls kammarglas (inkludera det negativa kontrollvillkoret genom att tillsätta 50 μL PBS till cellerna).
    4. Tillsätt det tidigare lagrade konditionerade mediet (steg 10.1.2) till varje brunn och inkubera i 24 timmar.
    5. Kassera mediet och tvätta cellerna 2x med PBS.
    6. Tillsätt en 4 % paraformaldehydlösning (PFA), kompletterad med 4 % sackaros i PBS, förvärmd till 37 °C, till varje brunn och inkubera i rumstemperatur i 20 minuter.
    7. Tvätta 2 gånger med PBS och förvara vid 4 °C tills avbildning utförs (pauspunkt).
    8. Ta bilder på ett inverterat fluorescensmikroskop utrustat med ett 10x/0.30-objektiv, eller ett inverterat konfokalmikroskop utrustat med ett 40x/1.4 Oil DIC-objektiv.
  2. För att få en mer relevant och reflekterande modell av in vivo-miljön , använd primära neuronala kulturer enligt följande:
    1. Förbered primära kulturer av kortikala neuroner som tidigare beskrivits av Santos et al.57. Kortfattat, frö 200 000 celler/ml i 12-brunnsplattor och håll dem i kultur fram till dag in vitro 16.
    2. Samla upp konditionerat medium från varje brunn (100 μL) och förvara det vid 4 °C för senare användning.
    3. Tillsätt de rAAVs som ska testas i varje brunn: totalt 2,75 × 109 vg koncentrerade rAAVs utspädda i 25 μl PBS (inklusive den negativa kontrollen: 25 μl PBS). Inkubera i 24 timmar vid 37 °C i en atmosfär med 5 % CO2 .
    4. Tillsätt det konditionerade mediet som tidigare lagrats och inkubera i 24 timmar.
    5. Kassera mediet i varje brunn och tvätta 2 gånger med PBS.
    6. Fixera cellerna med 4 % PFA/4 % sackaros i PBS, enligt beskrivningen i steg 10.1.6. Tvätta 2 gånger med PBS.
    7. Inkubera varje brunn med 5 μg/ml vetegroddagglutinin (WGA) konjugerad med Alexa Fluor 633 i 10 minuter vid rumstemperatur (valfritt steg: utför immuncytokemi istället). Tvätta 2 gånger med PBS.
    8. Inkubera i 0,25 % Triton X-100 i PBS i 5 minuter vid rumstemperatur. Tvätta med PBS.
    9. Inkubera med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i 5 minuter vid rumstemperatur. Tvätta 2 gånger med PBS.
    10. Ta bilder på ett inverterat fluorescensmikroskop utrustat med ett 40x/0.95 objektiv, eller ett inverterat konfokalmikroskop utrustat med ett 40x/1.4 Oil DIC-objektiv.

11. Experiment in vivo

OBS: Djuren var inhysta i ett temperaturkontrollerat rum som hölls på en 12 timmars ljus/mörk cykel. Mat och vatten tillhandahölls ad libitum. Alla ansträngningar gjordes för att minimera djurens lidande.

  1. Stereotaktisk injektion i lillhjärnan
    1. Bedöva 9 veckor gamla C57BL/6-djur genom inandning av 2 % isofluran i närvaro av syre (0,8 l/min) i en kammare ansluten till en förångare.
    2. Placera det sövda djuret i den stereotaktiska apparaten (på en 35 °C uppvärmd dyna) och placera isofluranmasken i djurets näsa. Sänk isoflurannivån till 1,3-1,7%.
      OBS: Se till att djuret är korrekt bedövat innan du fortsätter (förlust av reflexen för flexion i båda bakbenen).
    3. Applicera glidande ögonsalva för att undvika uttorkning av hornhinnorna och injicera djuret med ett godkänt smärtstillande medel.
      OBS: Alla efterföljande steg måste utföras under sterila förhållanden.
    4. Efter att ha rakat pälsen på djurets huvud och desinficerat operationsområdet, exponera skallen och placera spetsen på en 30 G injektionsnål med trubbig spets, ansluten till en 10 μL Hamilton-spruta, direkt över bregma (använd bregma som noll för beräkning av stereotaktiska koordinater).
    5. Flytta nålen till den avsedda koordinaten och borra ett hål genom skallen där nålen kommer in.
      OBS: Inom ramen för denna studie utfördes en enda injektion centralt i lillhjärnan.
    6. Injicera 4 μl av en lösning av rAAVs innehållande totalt 8 × 109 vg, utspädd i PBS, med en infusionshastighet på 0,5 μL/min med hjälp av en automatisk injektor. Använd följande koordinater, beräknade från bregma, för att utföra en enda injektion centralt i lillhjärnan hos en vuxen C57BL/6-mus: antero-posterior: -6,5 mm; lateral: 0 mm; ventral: -2,9 mm.
      OBS: Dessa koordinater kan variera beroende på musstam, kön och ålder på de djur som används.
    7. För att minimera återflöde och tillåta viral vektordiffusion, när infusionen är klar, lämna sprutnålen vid dessa koordinater i 3 minuter, dra sedan långsamt tillbaka den 0,3 mm och låt den sitta kvar på plats i ytterligare 2 minuter innan den tas bort helt från mushjärnan.
    8. Stäng snittet och rengör det med ett desinfektionsmedel (t.ex. 10 % povidonjod).
    9. Låt djuren återhämta sig från narkosen innan du återför dem till deras hemburar.
  2. Insamling och beredning av vävnader
    OBS: I detta experiment observerades transduktionsnivåerna 12 veckor efter injektionen, men samma procedur kunde utvärderas så snart som 4 veckor efter injektionen.
    1. Terminal bedövning av djuren genom intraperitoneal administrering av en överdos av xylazin/ketamin (8/160 mg/kg kroppsvikt).
    2. Perkardiellt perfusion av djuren med iskall PBS i 6 minuter med en hastighet av 2,5 ml/min, följt av perfusion med en nyberedd iskall 4 % PFA-lösning i 10 minuter med samma hastighet.
    3. Fäst de utskurna hjärnorna i 4 % PFA över natten vid rumstemperatur och överför dem sedan till en 25 % sackaros/PBS-lösning för kryoskydd. När hjärnorna sjunkit (cirka 48 timmar senare), förvara dem vid -80 °C.
    4. Skär seriella sagittala sektioner med en tjocklek på 30 μm med hjälp av en kryostat vid -21 °C. För varje djur, samla 96 sagittala sektioner av en hjärnhalva i anatomiska serier som fritt flytande sektioner i PBS kompletterade med 0,05% natriumazid. Förvaras vid 4 °C tills vidare bearbetning.
  3. Standardimmunhistokemi för fluorescens
    1. Välj åtta sagittala sektioner per djur, på ett avstånd av 240 μm från varandra.
    2. Inkubera de fritt flytande sektionerna i blockerande/permeabiliseringslösning (0,1 % Triton X-100 innehållande 10 % normalt getserum (NGS) i PBS) i 1 timme vid rumstemperatur.
    3. Inkubera snitten över natten vid 4 °C med kycklingpolyklonal anti-GFP primär antikropp (1:1 000).
    4. Tvätta i 3 x 15 minuter i PBS och inkubera sektionerna i 2 timmar vid rumstemperatur med den sekundära antikroppen getpolyklonal anti-kycklingantikropp konjugerad till Alexa Fluor 488-fluorofor (1:200).
    5. Tvätta i 3 x 15 min i PBS. Inkubera med DAPI i 5 minuter i rumstemperatur.
    6. Tvätta i 3 x 15 min i PBS. Placera sektionerna i gelatinbelagda objektglas och täckglas med fluorescensmonteringsmedium.
    7. Ta bilder på ett fluorescensmikroskop utrustat med ett 20x/0.8 objektiv.

Representative Results

I detta arbete presenterar vi ett detaljerat protokoll för produktion, rening och karakterisering av mosaik-rAAVs (sammanfattat i figur 1), som har potential att rikta in sig på och transducera CNS (t.ex. AAV1 och AAV9), samtidigt som de är lämpliga för heparinaffinitetskromatografirening (AAV2). För att uppnå detta användes kapsider från naturliga AAV-serotyper 1, 2 och 9 för att utveckla mosaikvektorerna rAAV1/2 och rAAV2/9.

Innan start screenades plasmidpreparat med avseende på strukturell integritet. Förutom de nedbrytningar som krävs för att validera korrekt insättning av kloningsfragment, är det viktigt att konsekvent screena pITR-plasmider för att upptäcka potentiella ITR-deletioner/insättningar. Som ett exempel övervakades integriteten hos ITR i olika kloner av en pITR-plasmid efter plasmidnedbrytningen med restriktionsenzymet SmaI (tilläggsfigur S1).

Båda typerna av mosaikvektorer genererades genom samtransfektion av de respektive AAV-kapsidplasmiderna i förhållandet 1:1, enligt standardtransfektionsmetoder6. Kortfattat transfekterades HEK293T celler med i) en plasmid som innehåller transgenen av intresse packad mellan ITR (pITR) sekvenserna, ii) en plasmid som innehåller vildtyp AAV-genomet Rep och Cap ORFs av AAV2 och AAV1 eller AAV9 (pAAV-RC-plasmider) och iii) en plasmid som kodar de adenovirala proteinerna (E1A, E1B, E4 och E2A) samt adenovirusassocierade RNA som är nödvändiga för hjälparfunktioner (pHelper). Fyrtioåtta timmar senare skördades cellerna 6,36 och rAAVs renades från cellhomogenatet genom affinitetskromatografi med hjälp av ett FPLC-system. Som visas i figur 2A, efter kolonnjämvikt (jämviktssteg), applicerades celllysatet som innehöll rAAVs på kolonnen (provladdning). På grund av den naturliga affiniteten hos rAAV2 för heparin33, band rAAVs till kolonnens harts, medan andra komponenter utfördes i den löpande bufferten och detekterades av UV-monitorn (genomströmning), vilket resulterade i en ökning av absorbansen. Kolonnen tvättades därefter (tvättsteg) och rAAVs eluerades slutligen genom en ökning av NaCl-koncentrationen (elueringssteget). De eluerade virusen detekterades av UV-monitorn och samlades in i 1 ml fraktioner.

En representativ elueringstoppprofil för rAAV1/2 och rAAV2/9 visas i figur 2B respektive kompletterande figur S2A, med olika virala batcher som konsekvent uppvisar en enda topp som börjar vid fraktion F7 upp till F16. Topphöjden varierar mellan rAAV-produktioner, där högre toppar vanligtvis leder till högre rAAV-avkastning. Varje fraktion av de producerade rAAV1/2 och rAAV2/9 karakteriserades därefter med RT-qPCR för att bedöma virala titrater (Figur 2C och Kompletterande figur S2B).

För att karakterisera renheten hos det eluerade materialet undersöktes 40 μL av varje fraktion och av respektive genomströmning med 10 % SDS-polyakrylamidgelelektrofores (figur 2D för rAAV1/2 och kompletterande figur S2C för rAAV2/9). Coomassie blå färgning avslöjade tre huvudband i fraktioner F7-F16, med molekylvikter motsvarande VP1 (87 kDa), VP2 (72 kDa) och VP3 (62 kDa) kapsidproteiner av AAVs vid lämpliga förhållanden 1:1:10, som tidigare beskrivits av Van Vliet och kollegor14. I båda fallen, och baserat på UV-absorbans, RT-qPCR och gelbandsintensitet, är det tydligt att majoriteten av mosaik-rAAVs finns i fraktionerna F7 och F8 och börjar gradvis minska i fraktionerna F9-F16. Utöver de tre virala kapsidproteinerna detekterades ytterligare ett protein (eller proteiner) med en storlek på cirka 17 kDa i fraktionerna F8-F16.

För att eliminera detta samrenande protein eller dessa antigener filtrerades och koncentrerades fraktionerna F7-16 med hjälp av 100 KDa centrifugalfilterenheter och den slutliga rAAV-titern bestämdes med RT-qPCR (som visas i figur 3A,B för rAAV1/2). Det slutliga utbytet av en rAAV-produktion är beroende av pITR:s längd och komplexitet, integriteten hos ITR-sekvenser, cellodlingsförhållanden (t.ex. antal cellpassager) och transfektionseffektivitet 24,58,59,60,61. Icke desto mindre kan den slutliga titern justeras genom att utföra flera centrifugeringar av rAAV-beredningen med hjälp av 0,5 ml centrifugalfilterenheter (koncentrationssteg 2). För en slutlig volym i intervallet 50 till 100 μL består koncentrationerna enligt detta protokoll vanligtvis av mellan 2 × 109 och 5 × 1010 vg/μl (kvantifiering utförd med hjälp av den refererade titreringssatsen).

Renheten hos de slutliga rAAV-förberedelserna utvärderades sedan på en 10 % SDS-polyakrylamidgel. Som visas i figur 3C observerades endast tre band som representerar rAAVs kapsidproteiner för rAAV1/2-beredningen och inga detekterbara co-purerande proteiner identifierades. Dessa resultat överensstämde med de som erhölls för rAAV2/9 (tilläggsfigur S2C). För att bekräfta identiteten och ytterligare karakterisera renheten hos rAAV1/2- och rAAV2/9-vektorerna analyserades virusfraktioner och koncentrerade lager med western blot, med de specifika antikropparna B1 (tilläggsfigur S3A och tilläggsfigur S4A) och A69 (tilläggsfigur S3B och tilläggsfigur S4B). Medan antikroppen B1 känner igen en C-terminal epitop som är gemensam för alla VP-proteiner av de flesta AAV-serotyper62, känner klonen A69 endast igen epitoper av VP1 och VP263. Icke desto mindre kan vissa svaga band med molekylvikter lägre än VP3 (<62 kDa) också detekteras vid B1- och A69-märkning.

För att karakterisera den strukturella morfologin och ytterligare utvärdera renheten hos rAAVs visualiserades viruspartiklarna direkt av TEM. Denna teknik har varit standardförfarandet för att bedöma provintegritet och renhet i virusprover, eftersom den möjliggör kvantifiering av tomma och fulla rAAV-partiklar, samt bedömning av kontaminering i ett prov 29,64,65,66,67. Som visas i figur 3D kunde stora mängder rAAV-partiklar, ~25 nm i diameter, observeras på en ren bakgrund. Tomma partiklar (svart pil) med ett elektrontätt centrum, samt fullständiga vektorer (vit pil) kunde också observeras i hela provfältet.

Vi utförde också kvalitetskontroll av de renade rAAV:erna med hjälp av Stunner, en plattform som kombinerar ultraviolett synlig (UV-Vis) spektroskopi, statisk ljusspridning (SLS) och dynamisk ljusspridning (DLS)68. För varje prov mättes den totala mängden protein, ssDNA, samt absorberande föroreningar och bakgrundsgrumlighet, med UV-Vis-spektroskopi (figur 3E och kompletterande figur S5A). SLS och DLS användes sedan för att bedöma det ljusspridande beteendet hos rAAV-kapsider. Med tanke på att AAV har en genomsnittlig diameter på 25 nm anses partiklar inom ett diameterområde på 15–45 nm vara intakta. Större partiklar representerar vanligtvis virusaggregat, och allt mindre består med största sannolikhet av små partiklar, inklusive osammansatta kapsidproteiner68. För rAAV1/2 observerades en enda topp motsvarande intakta kapsidpartiklar vid 30 nm (figur 3F), med 0 % av den aggregerade intensiteten och 0 % av intensiteten av små partiklar. För rAAV2/9-preparationen detekterades också en topp vid 30 nm som motsvarade en kapsidintensitet på 78 % (tilläggsfigur S5B). Även om intensiteten för små partiklar var 0 % uppmättes för detta prov en aggregerad intensitet på 22 % (avbildad i grått), med det största bidraget (19,9 %) från stora aggregat med en medeldiameter på 620 nm (tilläggsfigur S5B). Genom kombinationen av UV-Vis-spektroskopi med SLS- och DLS-information avslöjade Stunner den totala totala kapsidtitern, full kapsidtiter, fritt och aggregerat protein, samt fritt och aggregerat ssDNA för de två viruspreparaten, som visas i figur 3G och kompletterande figur S5C (specifika värden som anges i varje figurförklaring).

Parallellt, för att utvärdera den biologiska aktiviteten hos de utvecklade mosaik-AAV-vektorerna, infekterades HEK293T celler med 50 μL av varje FPLC-erhållen fraktion (F2-F16) av antingen rAAV1/2- eller rAAV2/9-preparatet. Eftersom rAAV1/2-vektorn kodar för ett enkelsträngat grönt fluorescerande protein (GFP), under kontroll av en CMV-promotor (pAAV-CMV-ssGFP), och rAAV2/9-vektorn kodar för en självkomplementär GFP, under kontroll av CMV-promotor (pAAV-CMV-scGFP53), undersöktes direkt GFP-fluorescens i dessa celler 48 timmar efter infektion (tilläggsfigur S6 och tilläggsfigur S7). I överensstämmelse med de tidigare observationerna för RT-qPCR, Coomassie blue och western blot uppnåddes den högsta infektivitetsnivån för virusfraktionerna F7 och F8, som gradvis minskade i fraktionerna F9 till F16.

För att bekräfta om den biologiska aktiviteten hos rAAVs bibehölls efter ultrafiltrering och koncentrationssteg, infekterades Neuro2A-celler, pläterade i både 24-brunnars plattor och ett 8-håls kammarglas, med den koncentrerade rAAV1/2-vektorn, som kodar för scGFP under kontroll av CMV-promotor (pAAV-CMV-scGFP53). Ljusfälts- och fluorescensbilder togs 48 timmar efter infektion (Figur 4A,B för bilder med högre upplösning).

I syfte att utforska den infektiösa kapaciteten hos de producerade rAAVs i en mer relevant och reflekterande cellmodell, såddes halvtäta primära neuronala kulturer från cortex på en 12-brunnars platta och infekterades med den tidigare använda rAAV1/2 - CMV-scGFP. Fyrtioåtta timmar efter infektion fixerades cellerna och märktes med DAPI och WGA konjugerade med Alexa Fluor 633, Ett mycket använt lektin för att märka fasta celler. Bilderna som visas i figur 4C,D togs med en Zeiss Axio Observer Z1 och på en Zeiss konfokal LSM 710. Som avbildas i dessa figurer av direkt GFP-fluorescens, bevarar koncentrerade mosaikvirus sina genöverföringsegenskaper för neuronala celler.

Efter att ha karakteriserat mosaik-rAAVs i termer av renhet, fysikaliska egenskaper och funktionalitet in vitro, utvärderade vi därefter möjligheten att använda de renade rAAV1/2-mosaikvektorerna för att transducera lillhjärnan hos C57BL/6-möss. För det utfördes en stereotaktisk injektion på 9 veckor gamla möss och GFP-uttrycket utvärderades 12 veckor senare. Som förväntat uppvisade djur som injicerades med PBS ingen fluorescens vid GFP-immunmärkning. Epifluorescensbilder från möss som injicerats med rAAV1/2-vektorer som kodar för GFP under kontroll av synapsin 1-promotorn (rAAV1/2 - Syn-ssGFP) avslöjade att rAAV1/2-vektorer framgångsrikt transducerade flera regioner i lillhjärnan, nämligen den djupa lillhjärnskärnan (DCN), samt de olika loberna i lillhjärnan (Figur 5). Dessa resultat visar det förlängda uttrycket av transgenen i däggdjurshjärnan (12 veckor).

Figure 1
Figur 1: Schematisk representation av rAAV-produktions- och reningsprotokollet. rAAVs produceras genom transient transfektion av HEK293T celler med hjälp av polyetylenimin (PEI). Därefter skördas och lyseras celler, och rAAVs renas från cellhomogenatet via affinitetskromatografi. De insamlade fraktionerna som innehåller rAAVs koncentreras sedan och de slutliga viruslagren karakteriseras i termer av titer, renhet, morfologiska egenskaper och biologisk aktivitet. Förkortningar: rAAV = rekombinant adenoassocierat virus; PEI = polyetylenimin; RT-qPCR = kvantitativ polymeraskedjereaktion i realtid; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: FPLC-reningsprotokoll och representativ elueringsprofil för rAAV1/2. A) Schematisk framställning av en komplett kromatogramprofil, som visar de olika stegen i rAAV-reningsprocessen. Efter ett kolonnjämviktssteg appliceras provet. Kolonnen tvättas sedan och elueringen utförs med ökande koncentrationer av NaCl. Det obundna materialet (genomströmningen) och 1 ml fraktioner av de eluerade virusen samlas in för analys. Absorbansen vid 280 nm uttrycks i mAU och x-axeln anger volymen i ml. (B) Förstorat partiellt kromatogram som visar en rAAV1/2-elueringstopp (i svart), med motsvarande fraktionsnummer (F2-F16) och avfall (markerat med rött). Den emitterade koncentrationen av buffert B och konduktivitet (uttryckt i mS/cm) visas också i grönt respektive lila. C) RT-qPCR för varje fraktion som samlats in under affinitetsrening (F2-F16) och genomströmning. Titern i vg/μL representeras på en logaritmisk skala. D) SDS-PAGE-analys av de insamlade virusfraktionerna. Lika stora volymer (40 μL) av varje fraktion från elueringssteget (F2-F16) och respektive genomströmning laddades och upplöstes på en 10 % SDS-polyakrylamidgel. Proteinband visualiserades genom Coomassie blue staining. Band som motsvarar AAV-kapsidproteinerna VP1, VP2 och VP3 är indicerade. Standardstegen för proteinstorlek betecknas som (L) och motsvarande molekylvikter anges också. Förkortningar: rAAV = rekombinant adenoassocierat virus; RT-qPCR = kvantitativ polymeraskedjereaktion i realtid; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Karakterisering av de koncentrerade rAAV1/2-vektorerna. (A) Amplifieringskurvor för ett koncentrerat rAAV1/2-prov (i blått), serieutspädda standarder från 2 × 107 vg/μL till 2 ×10 2 vg/μL (i svart) och en kontroll utan mall (i grönt), erhållen under RT-qPCR. (B) Standardkurva (linjär regression) för bestämning av titern för ett rAAV-prov i vg/μL. (C) SDS-PAGE-analys av de koncentrerade viruspartiklarna. Totalt 2,3 × 1010 vg av det koncentrerade buljongen poolades på gelen. (D) Transmissionselektronmikroskopibild av rAAV1/2-partiklar med ~25-30 nm i diameter. Tomma partiklar med ett elektrontätt centrum (bevisat av svarta pilar) kan skiljas från fullständiga kapsider (bevisat av vita pilar). Skalstapel = 100 nm. (E) Absorbansspektrum för ett rAAV1/2-preparat mätt med Stunner (i svart). Bidraget från proteiner (i blått), ssDNA (i grönt), andra UV-absorberande föreningar eller föroreningar (i lila) och bakgrundsgrumlighet (i grått) visas också. (F) DLS-intensitetsfördelning av rAAV1/2 med en enda topp vid 30 nm, uppmätt med Stunner. En kapsidspridningsintensitet på 100 % bestämdes genom att mäta arean under kurvan från 15 till 45 nm (skuggad grön). G) Bedövningsanalys av ett rAAV1/2-vektorpreparat som uppvisar en total kapsidtiter på 1,19 × 1014 cp/ml (mörkblå) och en full kapsidtiter på 1,73 ×10 13 vg/ml (mörkgrön). Ett fritt och aggregerat protein motsvarande 7,16 × 1012 cp/ml (ljusblått), samt ett fritt och aggregerat ssDNA motsvarande 1,04 ×10 12 vg/ml (ljusgrönt), mättes också. Förkortningar: rAAV = rekombinant adenoassocierat virus; RT-qPCR = kvantitativ polymeraskedjereaktion i realtid; SDS-PAGE = elektrofores av natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel; ssDNA = enkelsträngat DNA; DLS = dynamisk ljusspridning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: In vitro-bedömning av infektiabilitet av ett koncentrerat rAAV1/2-prov. (A) Neuro2A-celler infekterades med rAAV1/2 - CMV-scGFP eller inkuberades med en ekvivalent volym PBS, som en negativ kontroll. Ljusfälts- och fluorescensbilder av celler avbildade 48 timmar efter infektion. Bilderna togs i en Zeiss Axio Observer Z1 (10x objektiv). Skalstreck = 100 μm. (B) Detaljerade bilder av Neuro2A-celler 48 timmar efter infektion med rAAV1/2 - CMV-scGFP. Bilderna togs i en Zeiss LSM 710 (40x objektiv). Skalstänger = 20 μm. C) Halvtäta primära neuronala kulturer infekterade med rAAV1/2 - CMV-scGFP eller inkuberade med en ekvivalent volym PBS, som fungerar som en negativ kontroll. Cellerna märktes med en kärnfärgning (DAPI i blått) och en membranfläck (WGA i vitt). Bilderna togs i en Zeiss Axio Observer Z1 (40x objektiv). Skalstreck = 20 μm. (D) Detaljerade bilder av halvtäta primära neuronala kulturer 48 timmar efter infektion med rAAV1/2 - CMV-scGFP. Bilderna togs i en Zeiss LSM 710 (40x objektiv). Skalstänger = 20 μm. Förkortningar: rAAV = rekombinant adenoassocierat virus; CMV = cytomegalovirus; scGFP = självkomplementärt grönt fluorescerande protein; PBS = fosfatbuffrad koksaltlösning; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; WGA = agglutinin av vetegroddar. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: In vivo transduktionseffektivitet för rAAV1/2 efter en intraparenkymal injektion. Representativa immunofluorescensbilder som visar det utbredda GFP-uttrycket (i grönt) i hela lillhjärnan vid en central injektion av rAAV1/2 - Syn-ssGFP i lillhjärnan. Kärnorna färgades med DAPI (i blått). Skalstänger = 500 μm. Förkortningar: rAAV = rekombinant adenoassocierat virus; Syn = Synapsin 1; ssGFP = enkelsträngat grönt fluorescerande protein; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; PBS = fosfatbuffrad koksaltlösning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande figur S1: Analys av agarosgel av en rAAV-vektorplasmid spjälkad med SmaI. Sex kloner (C1-C6) av en pITR smältes med SmaI-restriktionsenzymet (banorna 2, 4, 6, 8, 10 och 12), som skär två gånger inom varje inverterad terminalupprepning. I det här fallet skulle en fullständig nedbrytning av denna pITR förväntas generera två band (3 796 bp och 3 013 bp). Vid framgångsrika förberedelser (C1, C3, C4 och C5) är ett band på 6809 bp, som är resultatet av partiell nedbrytning, fortfarande synligt (~5 % av det totala antalet). Vid preparat med ITR-rekombination är proportionerna omvända (C2), eller så skedde inte nedbrytningen (C6). De respektive icke-smälta klonerna presenteras också (banorna 3, 5, 7, 9, 11, 13). Förkortningar: rAAV = rekombinant adenoassocierat virus; ITR = inverterad terminalupprepning. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfigur S2: rAAV2/9-rening genom heparinbaserad affinitetskromatografi. (A) Elueringsprofil för rAAV2/9 som uppvisar en enda topp (i svart), efter en ökning av koncentrationen av NaCl. De insamlade fraktionerna indikeras med siffror (2-16) i rött längst ner i diagrammet, absorbansen vid 280 nm uttrycks i mAU, konduktiviteten uttrycks i mS/cm och x-axeln anger volymen i ml. B) rAAV-titrar kvantifierade med RT-qPCR för varje poolad fraktion (F2-F16) och genomströmning. Värdena representeras på en logaritmisk skala. (C) Renhetsanalys med SDS-PAGE och Coomassie blå färgning. Lika stora volymer (40 μL) av varje fraktion (F2-F16) och respektive genomströmning laddades och upplöstes på en 10 % SDS-SIDA. Koncentrerad stam kvantifierades med RT-qPCR och 2,3 ×10 10 vg späddes i 40 μL PBS och poolades på gelen. Proteinband visualiserades genom Coomassie blue staining. AAV-kapsidproteinerna (VP1, VP2 och VP3) är indicerade. Standardstegen för proteinstorlek betecknas med (L) och motsvarande molekylvikter anges också. Förkortningar: rAAV = rekombinant adenoassocierat virus; RT-qPCR = kvantitativ polymeraskedjereaktion i realtid; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur S3: Western blot-analys av rAAV1/2-vektorer renade med FPLC. (A) De insamlade fraktionerna och de koncentrerade rAAV1/2-vektorerna upplöstes på en SDS-PAGE-gel och undersöktes med monoklonal anti-AAV-antikropp (B1) från möss som känner igen VP1-, VP2- och VP3-kapsidproteiner. (B) De insamlade fraktionerna och de koncentrerade rAAV1/2-vektorerna upplöstes på en SDS-PAGE-gel och undersöktes med monoklonal anti-AAV-antikropp (A69) från möss som känner igen VP1- och VP2-kapsidproteiner. Förkortningar: rAAV = rekombinant adenoassocierat virus; FPLC = snabb proteinvätskekromatografi; SDS-PAGE = elektrofores av natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel; L = standardstege för proteinstorlek. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfigur S4: Western blot-analys av rAAV2/9-vektorer renade med FPLC. (A) De insamlade fraktionerna och de koncentrerade rAAV2/9-vektorerna upplöstes på en SDS-PAGE-gel och undersöktes med monoklonal anti-AAV-antikropp (B1) från möss som känner igen kapsidproteinerna VP1, VP2 och VP3. (B) De insamlade fraktionerna och de koncentrerade rAAV2/9-vektorerna upplöstes på en SDS-PAGE-gel och undersöktes med monoklonal anti-AAV-antikropp (A69) från möss som känner igen VP1- och VP2-kapsidproteiner. Förkortningar: rAAV = rekombinant adenoassocierat virus; FPLC = snabb proteinvätskekromatografi; SDS-PAGE = elektrofores av natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel; L = standardstege för proteinstorlek. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur S5: rAAV2/9 vektorkvantifiering och karakterisering via Stunner. (A) Absorbansspektrum (svart) för en rAAV2/9-vektor mätt med Stunner. Bidraget från proteiner (blått), ssDNA (grönt), andra UV-absorberande föreningar eller föroreningar (lila) och bakgrundsgrumlighet (grå) avbildas också. (B) DLS-intensitetsfördelning av rAAV2/9 med en större topp vid 30 nm motsvarande en kapsidspridningsintensitet på 78 %, fastställd genom mätning av arean under kurvan från 15 till 45 nm (skuggad grön). En total intensitet på 22 % (skuggad i grått) uppmättes också med ett huvudbidrag från stora aggregat (19,9 %) med en medeldiameter på 620 nm. (C) Bedövningsanalys av ett rAAV2/9-vektorpreparat som uppvisar en total kapsidtiter på 2,18 ×10 14 cp/ml (mörkblå) och en full kapsidtiter på 2,35 × 1013 vg/ml (mörkgrön). Ett fritt och aggregerat protein motsvarande 2,92 × 1013 cp/ml (ljusblått), samt ett fritt och aggregerat ssDNA motsvarande 3,14 ×10 12 vg/ml (ljusgrönt), mättes också i detta preparat. Förkortningar: rAAV = rekombinant adenoassocierat virus; ssDNA = enkelsträngat DNA; DLS = dynamisk ljusspridning. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfigur S6: In vitro-transduktionseffektivitet och viabilitet för de renade fraktionerna av rAAV1/2. HEK293T celler som uttrycker GFP (direkt fluorescens) 48 timmar efter transduktion med 50 μL FPLC-fraktioner av en rAAV1/2-vektor som kodar för ssGFP (rAAV1/2 - CMV-ssGFP). Skalstänger = 100 μm. Förkortningar: rAAV = rekombinant adenoassocierat virus; FPLC = snabb proteinvätskekromatografi; ssGFP = enkelsträngat grönt fluorescerande protein. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfigur S7: In vitro-transduktionseffektivitet och viabilitet för de renade fraktionerna av rAAV2/9. HEK293T cellerna infekterades med 50 μL av varje FPLC-fraktion (F2-F16) eller genomströmning av en rAAV2/9-vektor som kodar för scGFP under kontroll av CMV-promotorn. De GFP-uttryckande cellerna visualiserades 48 timmar efter infektion. Skalstänger = 100 μm. Förkortningar: rAAV = rekombinant adenoassocierat virus; FPLC = snabb proteinvätskekromatografi; scGFP = självkomplementärt grönt fluorescerande protein; CMV = cytomegalovirus. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Den snabbt växande AAV-vektorverktygslådan har blivit ett av de mest lovande genleveranssystemen för ett brett spektrum av celltyper genom olika administreringsvägar. I detta arbete syftade vi till att utveckla ett förbättrat protokoll för produktion, rening och karakterisering av mosaik-rAAV-vektorer som skulle kunna bevisa sitt värde i prekliniska studier. För detta ändamål beskrivs här genereringen av rAAV1/2- och rAAV2/9-mosaikvektorer, men proceduren kan också tillämpas för att rena standardvektorer för rAAV2 (data visas inte).

Mosaik rAAVs producerades efter en optimerad transfektionsmetod med PEI som transfektionsreagens. En transient transfektionsmetod valdes på grund av dess större flexibilitet och snabbhet, vilket är betydande fördelar i prekliniska studier i tidig fas. När en viss transgen och serotyp har validerats kan produktionssystemet finjusteras för att uppnå bättre skalbarhet och kostnadseffektivitet genom att etablera en stabil transfekterad cellinje som uttrycker en delmängd av de specifika Rep/Cap-generna , med ytterligare gener som tillhandahålls av en infektionsprocess24. Jämfört med kalcium-fosfattransfektion har PEI flera fördelar. Det är ett stabilt och kostnadseffektivt transfektionsreagens som fungerar effektivt inom ett bredare pH-område. Dessutom eliminerar det kravet på att byta cellmedium efter transfektion, vilket resulterar i en betydande minskning av både kostnader och arbetsbelastning69.

I ett försök att kringgå några av de begränsningar som CsCl- eller jodixanolgradienter medförde, skördades och renades de producerade rAAV:erna genom affinitetskromatografi. Denna strategi erbjuder ett förenklat och skalbart tillvägagångssätt som kan utföras utan behov av ultracentrifugering och gradienter, vilket ger rena och höga virala titrar. Faktum är att kromatografitekniker som använder ett FPLC-system kan automatiseras och skalas upp genom att packa mer hartsvolym i en kolonn med högre bäddhöjd. Protokollet som beskrivs häri kan enkelt anpassas för att inkludera 5 ml HiTrap Heparin HP-kolonner (data visas inte). Dessutom kan heparinkolonner återanvändas flera gånger, vilket bidrar till kostnadseffektiviteten för denna metod.

De renade rAAVerna karakteriserades sedan i termer av titer, renhet, morfologiska egenskaper och biologisk aktivitet. Intressant nog detekterades vid Coomassie blå färgning ett band med cirka 17 kDa i fraktionerna F8-F16 utöver de tre typiska virala kapsidproteinerna. Detta band är dock inte längre närvarande efter koncentrationssteget av rAAVs. Dessutom kan vissa svaga band med molekylvikter lägre än VP3 (<62 kDa) också detekteras vid B1- och A69-märkning, vilket tyder på att dessa kan vara fragment av kapsidproteinerna VP1, VP2 och VP370. En annan möjlighet är att dessa i själva verket är andra co-renande proteiner som ferritin eller andra cellulära proteiner med polypeptider som delar liknande proteinfingeravtryck med AAV-kapsidproteinerna och skulle kunna vara involverade i AAV-biologin, som tidigare föreslagits 26,71,72.

TEM- och bedövningsanalyser avslöjade också förekomsten av tomma partiklar på varierande nivåer i olika produktioner. På liknande sätt har andra studier tidigare rapporterat generering av variabla och höga nivåer (>65 %) av tomma kapsider för rAAVs framställda genom transfektions- eller infektionsmetoder24,73. Mekanismen bakom rAAV-generering börjar med den snabba bildningen av tomma kapsider från nyligen syntetiserade VP-proteiner, följt av ett långsamt hastighetsbegränsande steg av genompackning i de förformade kapsiderna medierade av Rep-proteiner74,75. Därför genereras tomma kapsider i rAAV-produktioner, även om andelen tomma och fulla kapsider kan variera beroende på storleken och sekvensen av den transgen av intresse och cellodlingsförhållanden58,73. Tomma kapsider ger upphov till vissa farhågor eftersom de, genom att sakna det aktuella genomet, inte kan ge en terapeutisk effekt och kan också potentiellt öka ett medfött eller adaptivt immunsvar. Vissa rapporter har dock också visat att, genom att justera deras förhållande, tomma AAV-kapsider kan fungera som mycket effektiva lockbeten för AAV-specifika neutraliserande antikroppar och därför öka transduktionseffektiviteten 60,76,77. Om närvaron av tomma kapsider är kritiskt skadlig och med tanke på den något mindre anjoniska karaktären hos tomma partiklar jämfört med fullvektorer, skulle en potentiell lösning kunna innebära att man genomför ett andra poleringsreningssteg med hjälp av anjonbyteskromatografitekniker64.

Denna studie ger också övertygande bevis för att de genererade mosaik-rAAVs effektivt kan transducera inte bara in vitro neuronala kulturer utan även CNS vid intrakraniell injektion av rAAV1/2. Sammantaget tyder dessa resultat på att det beskrivna produktions- och reningsprotokollet gör mycket rena och biologiskt aktiva rAAVs redo att användas inom 6 dagar, vilket presenterar sig som en mångsidig och kostnadseffektiv metod för generering av rAAVs i prekliniska studier.

Disclosures

Författarna deklarerar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Vi är tacksamma för samarbetet, insikterna och den tekniska assistansen från Dr. Mónica Zuzarte, vid Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR) och Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB), angående TEM-analysen av rAAVs. Vi uttrycker vår uppskattning till Dr. Dominique Fernandes, vid Centrum för neurovetenskap och cellbiologi vid University of Coimbra (CNC-UC) och Institutet för tvärvetenskaplig forskning vid University of Coimbra (IIIUC), för hennes ovärderliga tekniska stöd och insikter om de primära neuronala kulturexperimenten. Plasmiderna pRV1, pH21 och pFdelta6, som är nödvändiga för denna studie, tillhandahölls generöst av Dr. Christina McClure, vid School of Medical Sciences, College of Life Sciences and Medicine, University of Aberdeen, vilket vi är tacksamma för. Detta arbete finansierades av Europeiska regionala utvecklingsfonden (Eruf) genom det regionala operativa programmet Centro 2020. genom det operativa programmet för konkurrenskraft och internationalisering COMPETE 2020 och portugisiska nationella medel via FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, inom projekten: UIDB/04539/2020, UIDP/04539/2020, LA/P/0058/2020, ViraVector (CENTRO-01-0145-FEDER-022095), Imagene (PTDC/BBB-NAN/0932/2014 | POCI-01-0145-FEDER-016807), ReSet - IDT-COP (CENTRO-01-0247-FEDER-070162), Bekämpa Sars-CoV-2 (CENTRO-01-01D2-FEDER-000002), BDforMJD (CENTRO-01-0145-FEDER-181240), ModelPolyQ2.0 (CENTRO-01-0145-FEDER-181258), MJDEDIT (CENTRO-01-0145-FEDER-181266); av American Portuguese Biomedical Research Fund (APBRF) och Richard Chin and Lily Lock Machado-Joseph Disease Research Fund, ARDAT inom ramen för IMI2 JU Grant Agreement nr 945473 som stöds av EU och EFPIA, GeneT-Teaming Project 101059981 stöds av EU:s Horizon Europe-program. M.M.L. stöddes av 2021.05776.BD; C.H. stöddes av 2021.06939.BD; A.C.S. stöddes av 2020.07721.BD; och D.D.L. stöddes av 2020.09668.BD. Figur 1 skapades med hjälp av BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% povidone-iodine Medline MDS093943
12-well plates Thermo Scientific 11889684
24-well plates VWR 734-2325
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Invitrogen D1306
96-well Stunner plate Unchained Labs 701-2025 96-well quantification plate for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples
AAVpro Titration Kit (for Real-Time PCR) Ver.2 Takara 6233 For determining the titer of AAV using RT-qPCR. This kit contains DNase I, Lysis Buffer, Dilution Buffer, positive control, Taq II mix, primer forward, primer reverse, water
Acetic acid glacial Fisher Chemical A/0360/PB17
ÄKTA pure 25 Cytiva 29018224 FPLC system controlled by UNICORN software, version 6.3 
Alkaline phosphatase-linked goat anti-mouse Invitrogen 31328
Amicon ultra-0.5 centrifugal filter unit Merck Millipore UFC5100
Amicon ultra-15 centrifugal filter unit Merck Millipore UFC9100
Benzonase Nuclease Merck Millipore E1014
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
CFX96 Real-Time PCR detection system Biorad 184-5096
ChemiDoc Touch Imaging System Bio-Rad Laboratories 1708370
Chicken polyclonal anti-GFP primary antibody Abcam ab13970
Coomassie Blue G250 Fisher Chemical C/P541/46
Dithiothreitol (DTT) Fisher Bioreagents BP17225
DMEM Sigma-Aldrich D5796
ECF Substrate for Western Blotting Cytiva RPN5785
FastDigest SmaI Thermo Scientific FD0663
FEI-Tecnai G2 Spirit Biotwin FEI Biotwin Transmission electron microscope
Fetal bovine serum Biowest S1810
Fluorescence mounting medium Dako S3023
Formvar-carbon coated 200 mesh grid  TAAB Laboratories Equipment F077/025
Gas evacuation apparatus RWD R546W
Glycerol Fisher BioReagents 10021083
Goat polyclonal anti-chicken antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11039
Hamilton needle 30G, Small Hub RN Needle, 25 mm, PST3 Hamilton 7803-07
Hamilton syringe (10 µL) Hamilton 7653-01
HEK293T American Type Culture Collection CRL-11268
HiTrap Heparin HP 1 x 5 mL Cytiva 17040701 Pre-packed heparin column
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL Cytiva 17040601 Pre-packed heparin column
Immobilon-P PVDF Membrane Merck Millipore IPVH00010
Isoflurane Braun 469860
Ketamine  Dechra Pharmaceuticals N/A Nimatek
Low-retention microcentrifuge tubes (2 mL) Fisher Scientific 11906965
Lunatic & Stunner Client software Unchained Labs N/A Client analysis software version 8.0.1.235. Software for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples
Methanol Fisher Chemical M/4000/FP21
Mouse monoclonal anti-AAV, VP1, VP2 antibody (A69) American Research Products 03-61057
Mouse monoclonal anti-AAV, VP1, VP2, VP3 antibody (B1) American Research Products 03-61058
Neuro2a American Type Culture Collection CCL-131
Normal goat serum Gibco 16210064
NucleoBond Xtra Maxi EF Macherey-Nagel 12738422
NZYColour Protein Marker II NZYtech MB09002
pAAV-CMV-scGFP Addgene 32396 Addgene plasmid # 32396; http://n2t.net/addgene:32396; RRID:Addgene_32396
pAAV-CMV-ssGFP Addgene 105530 Addgene plasmid # 105530; http://n2t.net/addgene:105530; RRID:Addgene_105530
pAAV2/9n Addgene 112865 Addgene plasmid # 112865; http://n2t.net/addgene:112865; RRID:Addgene_112865
Paraformaldehyde Acros Organics 10342243
PBS Fisher BioReagents BP2438
Penicillin-streptomycin Gibco 15140-122
Pluronic F-68 Non-ionic Surfactant (100x) Gibco 24040032
Polyethylenimine MAX, MW 40,000 Polysciences Europe 24765
R500 Series Compact Small Animal Anesthesia Machine - Isoflurane RWD N/A
Sample Inlet Valve V9-IS Cytiva 29027746
Sample pump P9-S Cytiva 29027745
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Sodium chloride Fisher Scientific 10428420
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher Bioreagents BP166
Sterile PVDF syringe filter Fisher Scientific 15191499
Stunner Platform Unchained Labs 700-2002 Equipment for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples
Superloop 150 mL Cytiva 18-1023-85
Superloop 50 mL Cytiva 18-1113-82
SURE 2 supercompetent cells Stratagene, Agilent Technologies HPA200152
Treated culture dishes Corning 734-1711
Tris base Fisher BioReagents BP152
Tris hydrochloride Fisher BioReagents BP153
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Trypsin-EDTA Gibco 25200-072
Wheat Germ Agglutinin (WGA) conjugated with Alexa Fluor 633 Invitrogen W21404
Xylazine Dechra Pharmaceuticals N/A Sedaxylan
Zeiss Axio Observer Z1 Carl Zeiss Microscopy GmbH N/A Inverted fluorescence microscope equiped with an EC Plan-Neofluar 10x/0.30 objective and a Plan-Apochromat 40x/0.95 objective
Zeiss Axio Scan.Z1 Carl Zeiss Microscopy GmbH N/A Slide scanner fluorescence microscope equipped with a Plan-Apochromat 20x/0.8 objective
Zeiss LSM 710 Carl Zeiss Microscopy GmbH N/A Inverted confocal microscope equipped with a Plan-Apochromat 40x/1.4 Oil DIC objective
µ-Slide 8 well Ibidi Ibidi 80826 8-well chamber slide

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. Adenovirus-associated defective virus particles. Science. 149 (3685), 754-756 (1965).
  2. Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system. Front Mol Neurosci. 7, 1-9 (2014).
  3. Muzyczka, N. Use of Adeno-Associated Virus as a General Transduction Vector for Mammalian Cells. Viral Expression Vectors. 158, 97-129 (1992).
  4. Goncalves, M. A. F. V Adeno-associated virus: from defective virus to effective vector. Virol J. 2, 43 (2005).
  5. Flotte, T. R. Gene therapy progress and prospects: recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors. Gene Ther. 11 (10), 805-810 (2004).
  6. Grieger, J. C., Choi, V. W., Samulski, R. J. Production and characterization of adeno-associated viral vectors. Nat Protoc. 1 (3), 1412-1428 (2006).
  7. Ojala, D. S., Amara, D. P., Schaffer, D. V Adeno-Associated Virus Vectors and Neurological Gene Therapy. Neuroscientist. 21 (1), 84-98 (2014).
  8. Saraiva, J., Nobre, R. J., Pereira de Almeida, L. Gene therapy for the CNS using AAVs: The impact of systemic delivery by AAV9. Journal of Controlled Release. 241, 94-109 (2016).
  9. Agbandje-McKenna, M., Kleinschmidt, J. AAV capsid structure and cell interactions. Methods Mol Biol. 807, 47-92 (2011).
  10. Sonntag, F., Schmidt, K., Kleinschmidt, J. A. A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (22), 10220-10225 (2010).
  11. Sonntag, F., et al. The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes. J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).
  12. Gao, G., et al. Clades of Adeno-associated viruses are widely disseminated in human tissues. J Virol. 78 (12), 6381-6388 (2004).
  13. Gao, G., Vandenberghe, L. H., Wilson, J. M. New recombinant serotypes of AAV vectors. Curr Gene Ther. 5 (3), 285-297 (2005).
  14. Van Vliet, K. M., Blouin, V., Brument, N., Agbandje-McKenna, M., Snyder, R. O. The role of the adeno-associated virus capsid in gene transfer. Methods Mol Biol. 437, 51-91 (2008).
  15. Clark, K. R., Voulgaropoulou, F., Fraley, D. M., Johnson, P. R. Cell lines for the production of recombinant adeno-associated virus. Hum Gene Ther. 6 (10), 1329-1341 (1995).
  16. Inoue, N., Russell, D. W. Packaging cells based on inducible gene amplification for the production of adeno-associated virus vectors. J Virol. 72 (9), 7024-7031 (1998).
  17. Liu, X., Voulgaropoulou, F., Chen, R., Johnson, P. R., Clark, K. R. Selective Rep-Cap gene amplification as a mechanism for high-titer recombinant AAV production from stable cell lines. Mol Ther. 2 (4), 394-403 (2000).
  18. Mathews, L. C., Gray, J. T., Gallagher, M. R., Snyder, R. O. [23] Recombinant adeno-associated viral vector production using stable packaging and producer cell lines. Methods Enzymol. 346, 393-413 (2002).
  19. Gao, G., et al. Purification of recombinant adeno-associated virus vectors by column chromatography and its performance in vivo. Hum Gene Ther. 11 (15), 2079-2091 (2000).
  20. Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. J Virol. 72 (3), 2224-2232 (1998).
  21. Aponte-Ubillus, J. J., et al. Molecular design for recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector production. Appl Microbiol Biotechnol. 102 (3), 1045-1054 (2018).
  22. Smith, R. H., Levy, J. R., Kotin, R. M. A simplified baculovirus-AAV expression vector system coupled with one-step affinity purification yields high-titer rAAV stocks from insect cells. Mol Ther. 17 (11), 1888-1896 (2009).
  23. Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. Novel tools for production and purification of recombinant adenoassociated virus vectors. Hum Gene Ther. 9 (18), 2745-2760 (1998).
  24. Wright, J. F. Transient transfection methods for clinical adeno-associated viral vector production. Hum Gene Ther. 20 (7), 698-706 (2009).
  25. Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes. Hum Gene Ther. 22 (5), 613-624 (2011).
  26. Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., Lamla, T. Comparative analysis of cesium chloride- and iodixanol-based purification of recombinant adeno-associated viral vectors for preclinical applications. Hum Gene Ther Methods. 26 (4), 147-157 (2015).
  27. Zolotukhin, S., et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Ther. 6 (6), 973-985 (1999).
  28. Anderson, R., Macdonald, I., Corbett, T., Whiteway, A., Prentice, H. G. A method for the preparation of highly purified adeno-associated virus using affinity column chromatography, protease digestion and solvent extraction. J Virol Methods. 85 (1-2), 23-34 (2000).
  29. Okada, T., et al. Scalable purification of adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) and AAV8 vectors, using dual ion-exchange adsorptive membranes. Hum Gene Ther. 20 (9), 1013-1021 (2009).
  30. Guo, P., et al. Rapid and simplified purification of recombinant adeno-associated virus. J Virol Methods. 183 (2), 139-146 (2012).
  31. Lock, M., et al. Rapid, simple, and versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Hum Gene Ther. 21 (10), 1259-1271 (2010).
  32. Wang, L., Blouin, V., Brument, N., Bello-Roufai, M., Francois, A. Production and Purification of Recombinant Adeno-Associated Vectors. Adeno-Associated Virus: Methods and Protocols. 807, 361-404 (2011).
  33. Summerford, C., Samulski, R. J. Membrane-associated heparan sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated virus type 2 virions. J Virol. 72 (2), 1438-1445 (1998).
  34. Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. Adeno-associated Virus Serotypes: Vector Toolkit for Human Gene Therapy. Molecular Therapy. 14 (3), 316-327 (2006).
  35. Mietzsch, M., Broecker, F., Reinhardt, A., Seeberger, P. H., Heilbronn, R. Differential adeno-associated virus serotype-specific interaction patterns with synthetic heparins and other glycans. J Virol. 88 (5), 2991-3003 (2014).
  36. McClure, C., Cole, K. L. H., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. JoVE. (57), e3348 (2011).
  37. Auricchio, A., O’Connor, E., Hildinger, M., Wilson, J. M. A single-step affinity column for purification of serotype-5 based adeno-associated viral vectors. Mol Ther. 4 (4), 372-374 (2001).
  38. Wang, Q., et al. Identification of an adeno-associated virus binding epitope for AVB sepharose affinity resin. Mol Ther Methods Clin Dev. 2, 15040 (2015).
  39. Mietzsch, M., et al. OneBac: platform for scalable and high-titer production of adeno-associated virus serotype 1–12 vectors for gene therapy. Hum Gene Ther. 25 (3), 212-222 (2014).
  40. Mietzsch, M., et al. Characterization of AAV-specific affinity ligands: consequences for vector purification and development strategies. Mol Ther Methods Clin Dev. 19, 362-373 (2020).
  41. Florea, M., et al. High-efficiency purification of divergent AAV serotypes using AAVX affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 28, 146-159 (2023).
  42. Koerber, J. T., Jang, J. -H., Yu, J. H., Kane, R. S., Schaffer, D. V. Engineering adeno-associated virus for one-Step purification via immobilized metal affinity chromatography. Hum Gene Ther. 18 (4), 367-378 (2007).
  43. Zhang, H. -G., et al. Addition of six-His-tagged peptide to the C terminus of adeno-associated virus VP3 does not affect viral tropism or production. J Virol. 76 (23), 12023-12031 (2002).
  44. Arnold, G. S., Sasser, A. K., Stachler, M. D., Bartlett, J. S. Metabolic biotinylation provides a unique platform for the purification and targeting of multiple AAV vector serotypes. Mol Ther. 14 (1), 97-106 (2006).
  45. Rabinowitz, J. E., et al. Cross-dressing the virion: the transcapsidation of adeno-associated virus serotypes functionally defines subgroups. J Virol. 78 (9), 4421-4432 (2004).
  46. Hauck, B., Chen, L., Xiao, W. Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors. Mol Ther. 7 (3), 419-425 (2003).
  47. Choi, V., McCarty, D., Samulski, R. AAV hybrid serotypes: improved vectors for gene delivery. Curr Gene Ther. 5 (3), 299-310 (2005).
  48. Nonnenmacher, M., van Bakel, H., Hajjar, R. J., Weber, T. High capsid–genome correlation facilitates creation of AAV libraries for directed evolution. Mol Ther. 23 (4), 675-682 (2015).
  49. Kimura, K., et al. A mosaic adeno-associated virus vector as a versatile tool that exhibits high levels of transgene expression and neuron specificity in primate brain. Nat Commun. 14 (1), 4762 (2023).
  50. Issa, S. S., Shaimardanova, A. A., Solovyeva, V. V., Rizvanov, A. A. Various AAV serotypes and their applications in gene therapy: an overview. Cells. 12 (5), 785 (2023).
  51. Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
  52. Lopes, M. M., et al. A new protocol for whole-brain biodistribution analysis of AAVs by tissue clearing, light-sheet microscopy and semi-automated spatial quantification. Gene Ther. 29 (12), 665-679 (2022).
  53. Gray, J. T., Zolotukhin, S. Design and construction of functional AAV vectors. Methods Mol Biol. 807, 25-46 (2011).
  54. Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors. Curr Protoc Hum Genet. , Chapter 12, Unit 12.9-12.9.21 (2007).
  55. Bennicelli, J., et al. Reversal of blindness in animal models of leber congenital amaurosis using optimized AAV2-mediated gene transfer. Mol Ther. 16 (3), 458-465 (2008).
  56. Fischer, M. D., Hickey, D. G., Singh, M. S., MacLaren, R. E. Evaluation of an optimized injection system for retinal gene therapy in human patients. Hum Gene Ther Methods. 27 (4), 150-158 (2016).
  57. Santos, S. D., et al. Contactin-associated protein 1 (Caspr1) regulates the traffic and synaptic content of α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA)-type glutamate receptors. J Biol Chem. 287 (9), 6868-6877 (2012).
  58. Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Mol Ther. 7 (1), 122-128 (2003).
  59. Dong, B., Nakai, H., Xiao, W. Characterization of genome integrity for oversized recombinant AAV vector. Mol Ther. 18 (1), 87-92 (2010).
  60. Wright, J. F. AAV empty capsids: For better or for worse. Mol Ther. 22 (1), 1-2 (2014).
  61. Asaad, W., et al. AAV genome modification for efficient AAV production. Heliyon. 9 (4), e15071 (2023).
  62. Wobus, C. E., et al. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).
  63. Wistuba, A., Kern, A., Weger, S., Grimm, D., Kleinschmidt, J. A. Subcellular compartmentalization of adeno-associated virus type 2 assembly. J Virol. 71 (2), 1341-1352 (1997).
  64. Qu, G., et al. Separation of adeno-associated virus type 2 empty particles from genome containing vectors by anion-exchange column chromatography. J Virol Methods. 140 (1-2), 183-192 (2007).
  65. Brument, N., et al. A versatile and scalable two-step ion-exchange chromatography process for the purification of recombinant adeno-associated virus serotypes-2 and -5. Mol Ther. 6 (5), 678-686 (2002).
  66. Potter, M., et al. A simplified purification protocol for recombinant adeno-associated virus vectors. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14034 (2014).
  67. Dobnik, D., et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. Front Microbiol. 10, 1570 (2019).
  68. Yang, Q. -E., et al. Rapid quality control assessment of adeno-associated virus vectors via Stunner. GEN Biotechnology. 1 (3), 300-310 (2022).
  69. Huang, X., et al. AAV2 production with optimized N/P ratio and PEI-mediated transfection results in low toxicity and high titer for in vitro and in vivo applications. J Virol Methods. 193 (2), 270-277 (2013).
  70. Salganik, M., et al. Evidence for pH-dependent protease activity in the adeno-associated virus capsid. J Virol. 86 (21), 11877-11885 (2012).
  71. Dong, B., et al. Proteomics analysis of co-purifying cellular proteins associated with rAAV vectors. PLoS One. 9 (2), e86453 (2014).
  72. Grieger, J. C., Soltys, S. M., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector. Mol Ther. 24 (2), 287-297 (2016).
  73. Wright, J. Product-related impurities in clinical-grade recombinant AAV vectors: characterization and risk assessment. Biomedicines. 2 (1), 80-97 (2014).
  74. Bennett, A., Mietzsch, M., Agbandje-McKenna, M. Understanding capsid assembly and genome packaging for adeno-associated viruses. Future Virol. 12 (6), 283-297 (2017).
  75. Myers, M. W., Carter, B. J. Assembly of adeno-associated virus. Virology. 102 (1), 71-82 (1980).
  76. Mingozzi, F., et al. Overcoming preexisting humoral immunity to AAV using capsid decoys. Sci Transl Med. 5 (194), (2013).
  77. Hoffman, B. E., Herzog, R. W. Covert warfare against the immune system: decoy capsids, stealth genomes, and suppressors. Mol Ther. 21 (9), 1648-1650 (2013).

Tags

Bioteknik utgåva 206
Isolering av adenoassocierade virala vektorer genom ett enstegs och halvautomatiskt heparinaffinitetskromatografiprotokoll
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lopes, M. M., Lopes, S. M., Baganha, … More

Lopes, M. M., Lopes, S. M., Baganha, R., Henriques, C., Silva, A. C., Lobo, D. D., Cortes, L., de Almeida, L. P., Nobre, R. J. Isolation of Adeno-Associated Viral Vectors Through a Single-Step and Semi-Automated Heparin Affinity Chromatography Protocol. J. Vis. Exp. (206), e66550, doi:10.3791/66550 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter