인간 배아 줄기 세포에서 Mitochondrial 복잡한 활동에 대한 탐색
Summary
이 비디오에서는, 우리는 인간의 배아 줄기 세포의 mitochondrial 호흡 체인 단지가 겔 활동 assays 사용하여 분석할 수있는 방법을 보여줍니다.
Abstract
Mitochondria 세포질 세포의 대사 및 항상성에 주요 역할을 organelles, 세포 신호 네트워크의 규제 및 프로그램 세포 사망 있습니다. Mitochondria 생산 ATP는 세포질 산화 환원 상태와 Ca2 + 균형을 조절 지방산을 catabolize, 헴, 세포핵, 스테로이드 호르몬, 아미노산을 합성하고, 단백질의 철 – 유황 클러스터를 조립 도움이됩니다. Mitochondria는 열 생산에 필수적인 역할을했습니다. mitochondrial 게놈의 변이는 인간의 장애 여러 종류의 원인이됩니다. mtDNA 변이의 축적이 노화와 상호 및 암의 개발에 중요한 역할을 가지고 의심됩니다. 모든 세포 유형에서 극히 중요한 역할로 인해, mitochondria의 기능은 또한 줄기 세포에 중요합니다. 주요 진보는 줄기 세포 생존, 증식 및 분화 능력에 대한 우리의 이해에되었습니다. 그러나 줄기 세포의 기능 활동은, 특히 그들의 에너지 상태, 아직 자세히 연구되지 않았습니다. 거의 아무것도 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)와 그들의 차별화된 전구체 자손의 mitochondrial 속성에 대한 알려진되지 않습니다. hESC 기능과 발달 가능성에 mitochondria의 역할을 이해하고 평가하는 한 가지 방법은 직접 mitochondrial 호흡 단지의 활동을 측정하는 것입니다. 여기, 우리는 hESCs의 다섯 호흡기 체인 단지를 분석하는 방법으로 젤 활동 시각화의 고해상도 명확한 기본 겔 전기 영동과 이후에 대해 설명합니다.
Protocol
Discussion
이 비디오에서는, 우리는 인간의 배아 줄기 세포, 높은 해상도 명확한 기본 겔 전기 영동 (hrCNE)하여 분리하고, 인 겔 촉매 활동 assays에 의해 이후의 분석에서 mitochondrial 단백질 단지의 추출을 설명합니다. hrCNE 파란색 기본 겔 전기 영동의 비교 해상도 mitochondrial 막 단백질 단지를 해결 및 – 겔 활동 assays를위한 우수합니다. 이 기술은 mitochondrial 호흡 단지 IV를 정할뿐만 아니라 hESCs과 그들의 유도체 자손 모두에 어?…
Acknowledgements
Teitell 연구소에서 인간 배아 줄기 세포 연구는 현재 재생 의료에 대한 캘리포니아 연구소 (CIRM) 씨앗 부여 RS1 – 00313에 의해 지원됩니다. 우리는 이러한 추가적인 연구에 조언과 통찰력을 제공하는 박사 칼라 쾰러 (UCLA)와 쾰러 실험실 구성원 감사합니다.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 0.5M EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | adjust pH to 8.0 with NaOH | |
| 1M NaCl | Sigma | S3014-500MG | ||
| 1M Sodium succinate | Fisher Scientific | S413-500 | ||
| 0.1M Sodium phosphate buffer pH 7.2 | Fisher Scientific | BP332-1 and BP329-1 | Mix 68.4 ml of 1M Na2HPO4 and 31.6 ml of 1M NaH2PO4 to prepare 0.1M sodium phosphate buffer with pH 7.2 at 25 C | |
| 1M Tricine, pH 7.0 (adjusted with NaOH) | EMD | 9010 | store at 4 C | |
| 1M imidazole/HCl, pH 7.0 | Sigma | I-2399 | store at 4 C | |
| 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP153-1 | ||
| 20% (wt/vol) dodecyl-b-D-maltoside (DDM) | Fluka | 44205-500MG | Dissolved in water. Store 1 ml aliquots at –20 C. | |
| 10% (wt/vol) digitonin (>50% purity, used without recrystallization) | Fluka | 37008-1G | Dissolved in water. Store 0.1–1 ml aliquots at –20 C. Should be warmed up to 95 C before use. | |
| 2M 6-aminohexanoic acid | Fluka | 07260-100G | store at 4 C | |
| 10x Ponceau S/glycerol stock solution | Sigma | P-3504 and G6279-1L | 0.1% Ponceau S, 50% glycerol, (wt/vol) in water. | |
| 10% w/v sodium deoxycholate | Fluka | 30970-25G | Dissolved in water. Must be protected from light. Adjust pH to 7.0 with HCl, filter and store at room temperature. | |
| 250 mM phenazine methasulfate (PMS) | TCI America | P0083 | Dissolved in DMSO and aliquoted. Store at –20 C. | |
| Nitro-blue tetrazolium (NBT) | Amresco | 0329-1G | ||
| 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | TCI America | D0078 | ||
| Pb(NO3)2 | Fisher Scientific | L62-100 | ||
| MgSO4 | Fisher Scientific | BP213-1 | ||
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-10 | ||
| Glycine | Fisher Scientific | G45-212 | ||
| Adenosine 5’-triphosphate disodium salt (ATP) | Sigma | A2383-5G | Grade I, minimum 99% | |
| beta-nicotineamide adenine dinucleotide (NADH) reduced form | Sigma | N-8129 | ||
| Cytochrome c From horse heart | Sigma | C2506-250MG | ||
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | ||
| 100x protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | Store at – 20 C. | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | ||
| Trypan blue Stain 0.4% | Gibco | 15250-061 | ||
| 10x Trypsin (0.5%) | Gibco | 15400-054 | ||
| Trypsin Inhibitor | Gibco | 17075-029 |
Riferimenti
- Wittig, I., Braun, H. -. P., Sch˫gger, H. Blue native PAGE. Nature Protocols. 1, 418-428 (2006).
- Wittig, I., Karas, M., Sch˫gger, H. High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. 6. Molecular & Cellular Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).
- Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Sch˫gger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28, 3811-3820 (2007).
- Castle, J. D., Coligan, J. E., Dunn, B. M., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. Purification of Organelles from Mammalian Cells. Current Protocols in Protein Science. 4.2, 4.2.1-4.2.57 (2007).
