Зондирование для митохондриального комплекса активность в эмбриональных стволовых клеток человека
Summary
В этом видео мы покажем вам, как дыхательной цепи митохондрий комплексы человеческие эмбриональные стволовые клетки могут быть проанализированы с помощью геля в анализах деятельности.
Abstract
Митохондрии являются цитоплазматические органеллы, которые имеют первостепенную роль в клеточном метаболизме и гомеостаза, регуляции клеточных сигналов сети, и запрограммированной смерти клетки. Митохондрии производить АТФ, регулирует окислительно-восстановительное состояние цитоплазматических и Ca2 + баланс, катаболизировать жирных кислот, синтез гема, нуклеотиды, стероидные гормоны, аминокислоты, а также помочь собрать железо-серные кластеры в белках. Митохондрии также имеют существенную роль в выработке тепла. Мутации митохондриального генома причиной нескольких видов человеческой расстройства. Накопление мутаций мтДНК коррелирует с возрастом и подозревается в важную роль в развитии рака. Из-за их жизненно важную роль во всех типах клеток, функции митохондрий, должны также иметь решающее значение для стволовых клеток. Основные успехи были достигнуты в нашем понимании жизнеспособности стволовых клеток, пролиферацию и дифференциацию мощности. Но функциональную активность стволовых клеток, в частности, статуса свою энергию, еще не был детально изучен. Почти ничего не известно о митохондриальной свойства человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и их дифференцированного потомства предшественника. Один из способов понять и оценить роль митохондрий в функции чЭСК и развития потенциала для непосредственного измерения активности митохондриальных дыхательных комплексов. Здесь мы описываем высоким разрешением ясно родной гель-электрофореза и последующей деятельности в геле визуализации как метод анализа пять комплексов дыхательной цепи ЭСК.
Protocol
Discussion
В этом видео, мы описали добычи митохондриальной белковых комплексов из человеческих эмбриональных стволовых клеток, их разделение на высокое разрешение ясно родной гель-электрофореза (hrCNE), а также последующий анализ на в-гель каталитического анализов деятельности. hrCNE решает митохондриальных ?…
Acknowledgements
Человека эмбриональных стволовых клеток исследований в лаборатории Teitell в настоящее время поддерживаются Калифорнийского института регенеративной медицины (CIRM) семена грант RS1-00313. Мы благодарим д-ра Карла Келер (UCLA) и членов Келер лаборатории для предоставления консультаций и понимание в этих и дополнительных исследований.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 0.5M EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | adjust pH to 8.0 with NaOH | |
| 1M NaCl | Sigma | S3014-500MG | ||
| 1M Sodium succinate | Fisher Scientific | S413-500 | ||
| 0.1M Sodium phosphate buffer pH 7.2 | Fisher Scientific | BP332-1 and BP329-1 | Mix 68.4 ml of 1M Na2HPO4 and 31.6 ml of 1M NaH2PO4 to prepare 0.1M sodium phosphate buffer with pH 7.2 at 25 C | |
| 1M Tricine, pH 7.0 (adjusted with NaOH) | EMD | 9010 | store at 4 C | |
| 1M imidazole/HCl, pH 7.0 | Sigma | I-2399 | store at 4 C | |
| 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP153-1 | ||
| 20% (wt/vol) dodecyl-b-D-maltoside (DDM) | Fluka | 44205-500MG | Dissolved in water. Store 1 ml aliquots at –20 C. | |
| 10% (wt/vol) digitonin (>50% purity, used without recrystallization) | Fluka | 37008-1G | Dissolved in water. Store 0.1–1 ml aliquots at –20 C. Should be warmed up to 95 C before use. | |
| 2M 6-aminohexanoic acid | Fluka | 07260-100G | store at 4 C | |
| 10x Ponceau S/glycerol stock solution | Sigma | P-3504 and G6279-1L | 0.1% Ponceau S, 50% glycerol, (wt/vol) in water. | |
| 10% w/v sodium deoxycholate | Fluka | 30970-25G | Dissolved in water. Must be protected from light. Adjust pH to 7.0 with HCl, filter and store at room temperature. | |
| 250 mM phenazine methasulfate (PMS) | TCI America | P0083 | Dissolved in DMSO and aliquoted. Store at –20 C. | |
| Nitro-blue tetrazolium (NBT) | Amresco | 0329-1G | ||
| 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | TCI America | D0078 | ||
| Pb(NO3)2 | Fisher Scientific | L62-100 | ||
| MgSO4 | Fisher Scientific | BP213-1 | ||
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-10 | ||
| Glycine | Fisher Scientific | G45-212 | ||
| Adenosine 5’-triphosphate disodium salt (ATP) | Sigma | A2383-5G | Grade I, minimum 99% | |
| beta-nicotineamide adenine dinucleotide (NADH) reduced form | Sigma | N-8129 | ||
| Cytochrome c From horse heart | Sigma | C2506-250MG | ||
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | ||
| 100x protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | Store at – 20 C. | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | ||
| Trypan blue Stain 0.4% | Gibco | 15250-061 | ||
| 10x Trypsin (0.5%) | Gibco | 15400-054 | ||
| Trypsin Inhibitor | Gibco | 17075-029 |
Riferimenti
- Wittig, I., Braun, H. -. P., Sch˫gger, H. Blue native PAGE. Nature Protocols. 1, 418-428 (2006).
- Wittig, I., Karas, M., Sch˫gger, H. High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. 6. Molecular & Cellular Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).
- Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Sch˫gger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28, 3811-3820 (2007).
- Castle, J. D., Coligan, J. E., Dunn, B. M., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. Purification of Organelles from Mammalian Cells. Current Protocols in Protein Science. 4.2, 4.2.1-4.2.57 (2007).
