Aislamiento de neutrófilos Protocolo
Summary
Los neutrófilos se encuentran entre las primeras células en llegar al sitio de la respuesta inmune inflamatoria, y sus funciones y mecanismos han sido ampliamente estudiados in vitro. Se demuestra un gradiente de densidad estándar método de separación para aislar los neutrófilos humanos de sangre entera utilizando los medios disponibles en el mercado de separación.
Abstract
Granulocitos neutrófilos polimorfonucleares (PMN) son los leucocitos más abundantes en los seres humanos y entre las primeras células en llegar al sitio de la respuesta inmune inflamatoria. Debido a su papel clave en la inflamación, las funciones de los neutrófilos como la locomoción, la producción de citoquinas, fagocitosis, y combatir las células tumorales son ampliamente estudiados. Para la caracterización de las funciones específicas de los neutrófilos, un método limpio, rápido y confiable de que los separa de otras células sanguíneas es deseable que los estudios in vitro, sobre todo porque los neutrófilos son de corta duración y deben ser utilizados dentro de 2-4 horas de su recolección. Este sentido, demuestran un gradiente de densidad estándar método de separación para aislar los neutrófilos humanos de sangre entera utilizando los medios disponibles en el mercado de separación que es una mezcla de sodio y metrizoato Dextran 500. El procedimiento consiste en capas de sangre entera en el medio de gradiente de densidad, centrifugación, separación de la capa de neutrófilos, y la lisis de los eritrocitos residual. Las células se lavan, se cuentan y se resuspendieron en tampón de concentración que se desee. Cuando se realiza correctamente, este método ha demostrado que el rendimiento de las muestras de> 95% de neutrófilos con la viabilidad> 95%.
Protocol
Discussion
El gradiente de densidad método de separación se utiliza para aislar los neutrófilos humanos de sangre total usando una mezcla de sodio y metrizoato Dextran 500. Este método se basa en el método de separación de leucocitos mononucleares por Boyum (1968), que fue modificada para la separación de los neutrófilos por Ferrante y Correa (1980).
Después de la recolección de un donante, la sangre entera pueden ser anticoagulados con EDTA, citrato o heparina. Ya que son de corta duración, los neutrófilos se debe utilizar dentro …
Acknowledgements
Financiación de los NIH R01 HL56621.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Lymphocyte Poly(R) | Reagent | Cedarlane Labs | PolymorphprepTM can be used as an alternative | |
| Hank’s Balanced Salt Solution without Calcium Chloride | Reagent | Invitrogen Gibco | ||
| Human Serum Albumin | Reagent | ZLB Bioplasma | ||
| Red Cell Lysis Buffer | Reagent | Roche Diagnostics | ||
| Centrifuge | Tool | |||
| Vortexer | Tool | |||
| Pasteur Pipettes and bulb | Tool | |||
| PolymorphprepTM | Reagent | Axis-Shield PoC | Alternative reagent to Lymphocyte-Poly (R) | |
| Syringe Filter | Altro | Millipore | SLGV033RS | Millex-GV, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma-sterilizable |
| Hank’s Balance Salt Solution with Calcium Chloride | Reagent | Invitrogen Gibco |
Riferimenti
- Boyum, A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Invest. 21, 77-83 (1968).
- England, J. M., Rowan, R. M. The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters. Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).
- Garcia, A. Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay. J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).
- Ferrante, A., Thong, Y. H. Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method. J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).
