Nuclei di isolamento dal tessuto neuronale del cervello umano Postmortem

Summary

L'eterogeneità cellulare del tessuto cerebrale rappresenta una limitazione significativa per lo studio delle marcature epigenetiche della cromatina perché la maggior parte saggi mancanza risoluzione singola cella. I neuroni sono in genere mescolati con glia altri e cellule non neuronali. Forniamo un protocollo per estrarre e raccogliere i nuclei neuronali dal cervello umano.

Abstract

Neuroni nel cervello umano si postmitotic in gran parte durante lo sviluppo prenatale, e quindi mantenere la loro nuclei per tutta la durata della vita piena. Tuttavia, poco si sa sui cambiamenti neuronali e organizzazione della cromatina nucleare durante il corso dello sviluppo e dell'invecchiamento, o in malattie croniche neuropsichiatrici. Tuttavia, ad oggi i test basati la maggior parte della cromatina e DNA (esclusi quelli di pesci) risoluzione mancanza singola cellula. A tal fine, la notevole eterogeneità cellulare del tessuto cerebrale rappresenta una limitazione significativa, perché di solito diverse sottopopolazioni di neuroni sono mescolati con diversi tipi di cellule gliali e di altre cellule non neuronali. Una possibile soluzione sarebbe far crescere specifiche culture di cellule-tipo, ma la maggior parte delle cellule del SNC, tra cui i neuroni, sono ex vivo sostenibile, nella migliore delle ipotesi, solo per poche settimane e quindi avrebbe fornito un modello incompleto per meccanismi epigenetici potenzialmente operanti in tutto il ciclo di vita completo . Ecco, mettiamo a disposizione un protocollo per estrarre e purificare i nuclei da congelati (non fisso) del cervello umano post-mortem. Il metodo prevede l'estrazione dei nuclei in tampone di lisi ipotonica, seguita da ultracentrifugazione e immunotagging con anticorpi anti-NeuN. Etichettati nuclei neuronali vengono poi raccolti separatamente utilizzando la fluorescenza-attivato ordinamento. Questo metodo dovrebbe essere applicabile a qualsiasi regione del cervello in una vasta gamma di specie e adatto per gli studi di immunoprecipitazione della cromatina con il sito-specifici e modifica-anticorpi anti-istoni, e per la metilazione del DNA ed altri test.

Protocol

Nuclei di estrazione Mettere 250 mg di tessuto cerebrale post-mortem congelato in 5 ml di Lysis Buffer 1 in douncer e posizionarlo sul ghiaccio. Per ricevere circa 5 milioni di nuclei dopo FACS ordinamento, useremo 1000 mg di tessuto per campione. Una volta che il tessuto si è scongelato, dounce il tessuto per 1 minuto, mentre sul ghiaccio. Prendete il tessuto omogeneizzato e posizionarlo in un tubo da 15 ml ultracentrifuga chiaro. Mettere la provetta in ghiaccio. Pren…

Discussion

Il protocollo presentato qui dovrebbe essere particolarmente utile per gli studi focalizzati sui cambiamenti epigenetici della cromatina neuronale e, più in generale, sul fenotipo molecolare del nucleo neuronale, durante il normale sviluppo delle malattie e l'invecchiamento, o neurologici o psichiatrici. Il metodo è particolarmente vantaggioso quando l'eterogeneità cellulare del tessuto cerebrale, tra cui i potenziali cambiamenti nei neuroni-to-glia razione durante il corso di invecchiamento oa causa di malattia sono un problema …

Materials

Reagents:

1. Lysis Buffer
0.32M	Sucrose	5.47 g
5 mM	CaCl2	250 µl
3 mM	Mg(Acetate)2	150 µl
0.1 mM	EDTA	10 µl
10mM	Tris-HCl, pH8	500 µl
1 mM	DTT	17 µl
0.1%	Triton X-100	50 µl
Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water

2. Sucrose Solution
1.8 M	Sucrose	30.78 g
3 mM	Mg(Acetate)2	150 µl
1 mM	DTT	17 µl
10 mM	Tris-HCl, pH8	500 µl
Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water

3. Dounce buffer
10 mM	Tris	0.242 g
4 mM	MgCl2	0.163 g
1 mM	CaCl2	0.03 g
Adjust pH to 7.5 and volume to 200 ml with Autoclaved water