人間の死後の脳組織から神経細胞核の単離
Summary
ほとんどのアッセイは、単一セルの分解能が不足しているため脳組織の細胞の不均質性は、クロマチンにおけるエピジェネティックなマーキングの研究のための重大な制約をもたらす。ニューロンは通常、グリア細胞および他の非神経細胞が混在しています。私たちは、人間の脳から神経細胞核を抽出して収集するプロトコルを提供しています。
Abstract
人間の脳のニューロンは、主に出生前の開発中に分裂となるため、完全な生涯を通じて、その核を維持する。しかし、少しは開発し、老化の過程で、または慢性の精神神経疾患における神経細胞のクロマチンと核組織の変化についてはほとんど知られていない。しかし、ほとんどのクロマチンおよびDNAベースのアッセイ（FISH以外の）不足、単一セルの分解能日付を記入すること。神経細胞の典型的に様々な亜集団がグリア細胞と他の非神経細胞の種類と混ざりされているため、この目的のために、脳組織のかなりの細胞の不均質性は、重要な制限をもたらす。一つの可能な解決策は、細胞型特異的な文化を育てることですが、神経細胞を含むほとんどの中枢神経系の細胞は、、数週間で、最高の状態で、持続可能なex vivoのであり、したがって潜在的に完全な寿命にわたって動作エピジェネティックな機構のための不完全なモデルを提供するであろう。ここで、我々は凍結（固定しない）人間の死後の脳から核を抽出し、精製するプロトコルを提供しています。方法は、抗NeuN抗体による超遠心やimmunotagging続いて、低張溶解緩衝液中で核の抽出を行います。標識された神経核は、蛍光活性化ソーティングを使用して別々に収集されます。このメソッドは、種の広い範囲内の任意の脳の領域に適用し、サイトと修正特異的抗ヒストン抗体とクロマチン免疫沈降の研究のための、およびDNAメチル化および他のアッセイに適しているはずです。
Protocol
Discussion
ここで紹介するプロトコルは、より一般的にはエピジェネティックな神経細胞クロマチンの変化と、上に、神経核の分子表現型上に、通常の開発と老化の間に、または神経学的または精神疾患に焦点を当てた研究のために特に有用であろう。潜在的な老化の過程でニューロンからグリアの配給量の変化や病気に起因するを含む脳組織の細胞の不均質性は、懸念さ1のときの方法が特に有利で ある…
Acknowledgements
著者らは、マサチューセッツ大学医学部でのフローサイトメトリーコアファシリティで博士リチャードKonzとスタッフによるアドバイスや技術的なご支援を賜りますようお願い申し上げます。糖尿病内分泌学研究センター助成DK032520でサポートされているコアのリソースも使用した。この作品は、国立精神衛生研究所（NIMH）、薬物乱用の国立研究所（NIDA）と母子保健と人間開発の国立研究所からの補助金によってサポートされています。
Materials
Reagents:
| 1. Lysis Buffer | ||
|---|---|---|
| 0.32M | Sucrose | 5.47 g |
| 5 mM | CaCl2 | 250 µl |
| 3 mM | Mg(Acetate)2 | 150 µl |
| 0.1 mM | EDTA | 10 µl |
| 10mM | Tris-HCl, pH8 | 500 µl |
| 1 mM | DTT | 17 µl |
| 0.1% | Triton X-100 | 50 µl |
| Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water | ||
| 2. Sucrose Solution | ||
|---|---|---|
| 1.8 M | Sucrose | 30.78 g |
| 3 mM | Mg(Acetate)2 | 150 µl |
| 1 mM | DTT | 17 µl |
| 10 mM | Tris-HCl, pH8 | 500 µl |
| Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water | ||
| 3. Dounce buffer | ||
|---|---|---|
| 10 mM | Tris | 0.242 g |
| 4 mM | MgCl2 | 0.163 g |
| 1 mM | CaCl2 | 0.03 g |
| Adjust pH to 7.5 and volume to 200 ml with Autoclaved water | ||
Riferimenti
- Siegmund, K. D., Connor, C. M., Campan, M., Long, T. I., Weisenberger, D. J., Biniszkiewicz, D., Jaenisch, R., Laird, P. W., Akbarian, S. DNA methylation in the human cerebral cortex is dynamically regulated throughout the life span and involves differentiated neurons. PLoS ONE. 2, 895-895 (2007).
- Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).
- Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. Retrospective birth dating of cells in humans. Cell. 122, 133-143 (2005).
- Acevedo, L. G., Iniguez, A. L., Holster, H. L., Zhang, X., Green, R., Farnham, P. J. Genome-scale ChIP-chip analysis using 10,000 human cells. Biotechniques. 43, 791-797 (2007).
