从人死后脑组织神经元细胞核分离
Summary
脑组织细胞的异质性，构成一个明显的局限性染色，因为大多数分析缺乏单细胞分辨率的表观遗传标记的研究。通常是神经元与神经胶质细胞和其他非神经元细胞混合。我们提供了一个协议提取和收集从人脑的神经元细胞核。
Abstract
人类大脑中的神经元在很大程度上成为有丝分裂期间胎儿发育，从而保持其在整个全寿命核。然而，鲜为人知的是，在神经细胞染色质和核组织的发育和衰老过程中的变化，或在慢性神经精神疾病。然而，迄今为止最染色质和DNA检测（鱼除外）缺乏单细胞分辨率。为此，相当大的脑组织细胞的异质性带来明显的局限性，因为通常是不同的亚群的神经元与神经胶质细胞和其他非神经元细胞的不同类型混合的。一种可能的解决方案将增长细胞类型的特定的文化，但最中枢神经系统的细胞，包括神经细胞，体外可持续，充其量只有几个星期，从而将提供一个表观遗传机制的不完整的模型，可能整个全寿命。在这里，我们提供了一个协议冻结（从来没有固定）人死后脑细胞核提取和纯化。该方法包括低渗裂解液中提取的原子核，其次是超速离心法和反NeuN抗体immunotagging。标记神经元的细胞核，然后收集分别用荧光激活排序。这种方法应该适用于任何一个物种的广泛的大脑区域，适用于染色质免疫沉淀与现场和修改特异性抗组蛋白抗体，和DNA甲基化和其他实验研究。
Protocol
Discussion
这里介绍的协议应重点研究神经细胞染色质的表观遗传变化，更普遍，特别是有用的，对神经细胞的细胞核，在正常的发展和老龄化，或在神经或精神疾病，分子表型。当脑组织细胞的异质性，包括潜在的变化在老化过程中神经元的神经胶质细胞的口粮，或因疾病是关注1，该方法是特别的优势。例如，通过染色质免疫沉淀技术结合目前的排序协议，我们最近在大脑衍生神经营养因子（BDNF）基因启动子的…
Acknowledgements
作者感谢理查德博士Konz和工作人员在美国马萨诸塞大学医学院的流式细胞仪核心设施提供咨询和技术支持。也可用于糖尿病内分泌研究中心授予DK032520支持的核心资源。这项工作是由美国国立精神卫生研究所（NIMH），国家药物滥用研究所（NIDA）和国家儿童健康和人类发展研究所的赠款支持。
Materials
Reagents:
| 1. Lysis Buffer | ||
|---|---|---|
| 0.32M | Sucrose | 5.47 g |
| 5 mM | CaCl2 | 250 µl |
| 3 mM | Mg(Acetate)2 | 150 µl |
| 0.1 mM | EDTA | 10 µl |
| 10mM | Tris-HCl, pH8 | 500 µl |
| 1 mM | DTT | 17 µl |
| 0.1% | Triton X-100 | 50 µl |
| Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water | ||
| 2. Sucrose Solution | ||
|---|---|---|
| 1.8 M | Sucrose | 30.78 g |
| 3 mM | Mg(Acetate)2 | 150 µl |
| 1 mM | DTT | 17 µl |
| 10 mM | Tris-HCl, pH8 | 500 µl |
| Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water | ||
| 3. Dounce buffer | ||
|---|---|---|
| 10 mM | Tris | 0.242 g |
| 4 mM | MgCl2 | 0.163 g |
| 1 mM | CaCl2 | 0.03 g |
| Adjust pH to 7.5 and volume to 200 ml with Autoclaved water | ||
Riferimenti
- Siegmund, K. D., Connor, C. M., Campan, M., Long, T. I., Weisenberger, D. J., Biniszkiewicz, D., Jaenisch, R., Laird, P. W., Akbarian, S. DNA methylation in the human cerebral cortex is dynamically regulated throughout the life span and involves differentiated neurons. PLoS ONE. 2, 895-895 (2007).
- Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).
- Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. Retrospective birth dating of cells in humans. Cell. 122, 133-143 (2005).
- Acevedo, L. G., Iniguez, A. L., Holster, H. L., Zhang, X., Green, R., Farnham, P. J. Genome-scale ChIP-chip analysis using 10,000 human cells. Biotechniques. 43, 791-797 (2007).
