मानव शवपरीक्षा मस्तिष्क के ऊतकों से neuronal नाभिक अलगाव
Summary
मस्तिष्क के ऊतकों की सेलुलर विविधता chromatin है क्योंकि ज्यादातर assays एकल कक्ष संकल्प की कमी में epigenetic चिह्नों के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण सीमा बन गया है. न्यूरॉन्स आमतौर पर glia और अन्य गैर neuronal कोशिकाओं के साथ intermingled हैं. हम एक प्रोटोकॉल को निकालने और मानव मस्तिष्क से neuronal नाभिक इकट्ठा प्रदान करते हैं.
Abstract
मानव मस्तिष्क में न्यूरॉन्स postmitotic मोटे तौर पर जन्म के पूर्व का विकास के दौरान, बन गया है और इस प्रकार पूर्ण जीवन भर उनके नाभिक बनाए रखने के. हालांकि, neuronal chromatin और परमाणु संगठन में विकास और उम्र बढ़ने के दौरान परिवर्तन, या पुरानी neuropsychiatric बीमारी में थोड़ा के बारे में जाना जाता है. हालांकि, सबसे chromatin और डीएनए आधारित कमी (मछली की तुलना में) एक सेल संकल्प assays तिथि करने के लिए. यह अंत करने के लिए, मस्तिष्क के ऊतकों की काफी सेलुलर विविधता एक महत्वपूर्ण सीमा बन गया है, क्योंकि न्यूरॉन्स की आम तौर पर विभिन्न subpopulations glia और अन्य गैर neuronal कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के के साथ intermingled कर रहे हैं. एक संभव समाधान के लिए सेल प्रकार विशिष्ट संस्कृतियों बढ़ने के लिए हो सकता है, लेकिन सबसे न्यूरॉन्स सहित सीएनएस की कोशिकाओं, पूर्व स्थायी vivo हैं, केवल कुछ ही हफ्तों के लिए, सबसे अच्छा में है और इस प्रकार epigenetic तंत्र के लिए एक अधूरा मॉडल संभावित पूर्ण जीवन भर ऑपरेटिंग प्रदान करेगा . यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल को निकालने और जमे हुए (कभी नहीं तय) मानव शवपरीक्षा मस्तिष्क से नाभिक शुद्ध प्रदान करते हैं. विधि hypotonic lysis बफर में नाभिक के निष्कर्षण, और विरोधी NeuN एंटीबॉडी के साथ ultracentrifugation immunotagging द्वारा पीछा शामिल है. लेबल neuronal नाभिक तो अलग से एकत्र कर रहे हैं प्रतिदीप्ति सक्रिय छँटाई का उपयोग. इस विधि प्रजातियों में से एक विस्तृत श्रृंखला में किसी भी मस्तिष्क क्षेत्र के लिए लागू है और के साथ साइट और संशोधन विशेष विरोधी histone एंटीबॉडी, और डीएनए मेथिलिकरण और अन्य assays के लिए chromatin immunoprecipitation अध्ययन के लिए उपयुक्त होना चाहिए.
Protocol
Discussion
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल neuronal chromatin के epigenetic परिवर्तन और, और अधिक सामान्यतः पर ध्यान केंद्रित अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी होना चाहिए, सामान्य विकास और उम्र बढ़ने, या स्नायविक या मानसिक बीमारी के दौरान neuronal नाभि…
Acknowledgements
लेखकों को सलाह और तकनीकी सहायता फ्लो Cytometry कोर सुविधा में मैसाचुसेट्स मेडिकल स्कूल के विश्वविद्यालय में डॉ. रिचर्ड Konz और कर्मचारियों द्वारा प्रदान की सराहना करते हैं. कोर मधुमेह इन्डोकिरनोलाजी अनुसंधान केंद्र अनुदान DK032520 द्वारा समर्थित संसाधनों का भी इस्तेमाल किया गया. इस काम के मानसिक स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (NIMH), नशीली दवाओं के सेवन के राष्ट्रीय संस्थान (NIDA) और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ बाल स्वास्थ्य और मानव विकास से अनुदान द्वारा समर्थित है.
Materials
Reagents:
| 1. Lysis Buffer | ||
|---|---|---|
| 0.32M | Sucrose | 5.47 g |
| 5 mM | CaCl2 | 250 µl |
| 3 mM | Mg(Acetate)2 | 150 µl |
| 0.1 mM | EDTA | 10 µl |
| 10mM | Tris-HCl, pH8 | 500 µl |
| 1 mM | DTT | 17 µl |
| 0.1% | Triton X-100 | 50 µl |
| Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water | ||
| 2. Sucrose Solution | ||
|---|---|---|
| 1.8 M | Sucrose | 30.78 g |
| 3 mM | Mg(Acetate)2 | 150 µl |
| 1 mM | DTT | 17 µl |
| 10 mM | Tris-HCl, pH8 | 500 µl |
| Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water | ||
| 3. Dounce buffer | ||
|---|---|---|
| 10 mM | Tris | 0.242 g |
| 4 mM | MgCl2 | 0.163 g |
| 1 mM | CaCl2 | 0.03 g |
| Adjust pH to 7.5 and volume to 200 ml with Autoclaved water | ||
Riferimenti
- Siegmund, K. D., Connor, C. M., Campan, M., Long, T. I., Weisenberger, D. J., Biniszkiewicz, D., Jaenisch, R., Laird, P. W., Akbarian, S. DNA methylation in the human cerebral cortex is dynamically regulated throughout the life span and involves differentiated neurons. PLoS ONE. 2, 895-895 (2007).
- Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).
- Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. Retrospective birth dating of cells in humans. Cell. 122, 133-143 (2005).
- Acevedo, L. G., Iniguez, A. L., Holster, H. L., Zhang, X., Green, R., Farnham, P. J. Genome-scale ChIP-chip analysis using 10,000 human cells. Biotechniques. 43, 791-797 (2007).
