Изоляция нейронов ядра из человеческих тканей мозга Посмертные
Summary
Сотовые неоднородность ткани головного мозга создает значительные ограничения для изучения эпигенетической маркировки в хроматина, потому что большинство анализов отсутствие одной резолюции клетки. Нейроны обычно идут прямо глии и других не-нервных клеток. Мы предоставляем протокол для извлечения и собирать нейронов ядер от человеческого мозга.
Abstract
Нейроны человеческого мозга стали постмитотических основном в период внутриутробного развития, и таким образом поддерживать их ядер на протяжении всего срока службы. Тем не менее, мало известно об изменениях в нейронных хроматина и ядерной организации в ходе развития и старения, или при хронических психоневрологических заболеваний. Однако на сегодняшний день наиболее хроматина и ДНК на основе анализов (кроме рыбы) отсутствие одной резолюции клетки. Для этого, значительное сотовой неоднородность ткани мозга представляет существенное ограничение, так как обычно различные субпопуляции нейронов перемешаны с различными типами глии и других не-нервных клеток. Одно из возможных решений будет расти камерного типа конкретной культуры, но большинство ЦНС клеток, включая нейроны, являются бывшими естественных условиях устойчивого, в лучшем случае, лишь несколько недель, и таким образом обеспечит неполной моделью для эпигенетических механизмов потенциально операционных по всему продолжительность жизни . Здесь мы предоставляем протокол для извлечения и очистки ядер из замороженных (никогда не фиксированной) человеческого мозга посмертных. Метод включает в себя добычу ядер в гипотонический лизис буфера, а затем ультрацентрифугирования и immunotagging с анти-Neun антител. Маркированный нейронов ядра затем собирают отдельно с помощью флуоресцентной активированной сортировки. Этот метод должен быть применимы к любой области мозга, в широком диапазоне видов и пригодны для хроматин иммунопреципитации исследований с сайта и изменения конкретных анти-гистонов антител, а также для метилирования ДНК и другие анализы.
Protocol
Discussion
Протокол, представленные здесь должно быть особенно полезно для исследования сосредоточены на эпигенетические изменения нейронов хроматина и, более общо, на молекулярном фенотип нейронов ядра, при нормальном развитии и старении, или неврологическими или психиатрическими заболеваниями. Метод и…
Acknowledgements
Авторы ценят консультации и техническую поддержку со стороны д-р Ричард Конц и сотрудников на основной объект проточной цитометрии в Университете штата Массачусетс медицинской школы. Основные ресурсы, поддерживаемые Диабет Эндокринологический научный центр Грант DK032520 также были использованы. Работа выполнена при поддержке грантов от Национального института психического здоровья (NIMH), Национального института наркомании (NIDA) и Национального института детского здоровья и человеческого развития.
Materials
Reagents:
| 1. Lysis Buffer | ||
|---|---|---|
| 0.32M | Sucrose | 5.47 g |
| 5 mM | CaCl2 | 250 µl |
| 3 mM | Mg(Acetate)2 | 150 µl |
| 0.1 mM | EDTA | 10 µl |
| 10mM | Tris-HCl, pH8 | 500 µl |
| 1 mM | DTT | 17 µl |
| 0.1% | Triton X-100 | 50 µl |
| Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water | ||
| 2. Sucrose Solution | ||
|---|---|---|
| 1.8 M | Sucrose | 30.78 g |
| 3 mM | Mg(Acetate)2 | 150 µl |
| 1 mM | DTT | 17 µl |
| 10 mM | Tris-HCl, pH8 | 500 µl |
| Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water | ||
| 3. Dounce buffer | ||
|---|---|---|
| 10 mM | Tris | 0.242 g |
| 4 mM | MgCl2 | 0.163 g |
| 1 mM | CaCl2 | 0.03 g |
| Adjust pH to 7.5 and volume to 200 ml with Autoclaved water | ||
Riferimenti
- Siegmund, K. D., Connor, C. M., Campan, M., Long, T. I., Weisenberger, D. J., Biniszkiewicz, D., Jaenisch, R., Laird, P. W., Akbarian, S. DNA methylation in the human cerebral cortex is dynamically regulated throughout the life span and involves differentiated neurons. PLoS ONE. 2, 895-895 (2007).
- Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).
- Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. Retrospective birth dating of cells in humans. Cell. 122, 133-143 (2005).
- Acevedo, L. G., Iniguez, A. L., Holster, H. L., Zhang, X., Green, R., Farnham, P. J. Genome-scale ChIP-chip analysis using 10,000 human cells. Biotechniques. 43, 791-797 (2007).
