Neuronal Nuclei Isolering från Human obduktion hjärnvävnad

Summary

Det cellulära heterogenitet av hjärnvävnad utgör en betydande begränsning för studier av epigenetiska märkningar i kromatin eftersom de flesta analyser saknar enda cell upplösning. Nervceller vanligtvis samsas med Glia och andra icke-neuronala celler. Vi erbjuder ett protokoll för att hämta och samla neuronala kärnor från mänskliga hjärnan.

Abstract

Nervceller i den mänskliga hjärnan blir postmitotic till stor del under prenatal utveckling och därmed bibehålla sin kärnor genom hela livslängd. Dock är lite känt om förändringar i neuronala kromatin och kärnkraft organisation under utveckling och åldrande, eller kronisk neuropsykiatriska sjukdomar. Men hittills mest kromatin och DNA baserade analyser (andra än fiskar) saknar en enda cell upplösning. I detta syfte ställer stora cellulära heterogena hjärnvävnaden en betydande begränsning, eftersom det vanligtvis olika subpopulationer av nervceller samsas med olika typer av Glia och andra icke-neuronala celler. En möjlig lösning skulle vara att växa celltyp specifika kulturer, men de flesta CNS-celler, även neuroner, är ex vivo hållbara, i bästa fall endast ett par veckor och därmed skulle ge en ofullständig modell för epigenetiska mekanismer kan vara verksamma över hela livslängden . Här ger vi ett protokoll för att extrahera och rena kärnor från fryst (aldrig fast) mänskliga döden hjärnan. Metoden innebär extraktion av kärnor i hypoton lyseringsbuffert, följt av ultracentrifugering och immunotagging med anti-Neun antikropp. Märkta neuronala kärnor sedan samlas in separat med hjälp av fluorescens-aktiverade sortering. Denna metod bör tillämpas på alla hjärnan region i ett brett spektrum av arter och lämpar sig för kromatin immunoprecipitation studier med plats-och ombyggnad specifika anti-histon antikroppar, samt för DNA-metylering och andra analyser.

Protocol

Nuclei Extraktion Sätt 250 mg frysta obduktion hjärnvävnad i 5 ml lyseringsbuffert 1 i en douncer och placera den på is. För att ta emot ca 5 miljoner kärnor efter FACS sortering, använder vi oftast 1000 mg av vävnad per prov. När vävnad har tinat, dounce vävnaden i 1 minut medan på is. Ta det homogeniserade vävnad och placera den i en 15 ml klar ultracentrifugen rör. Sätt röret på is. Ta 9 mL sackaroslösning 2 med en pipett, placera pipett …

Discussion

Protokollet presenteras här bör vara särskilt användbart för studier fokuserade på epigenetiska förändringar av neuronala kromatin och mer allmänt, om den molekylära fenotyp av den neuronala kärnan, under normal utveckling och åldrande, eller i neurologisk eller psykiatrisk sjukdom. Metoden är särskilt fördel när cellulära heterogenitet hjärnvävnad, inklusive eventuella förändringar i neuron till Glia ranson under åldrande eller på grund av sjukdom är ett bekymmer ^1. Till exempel genom att kombinera de nuv…

Materials

Reagents:

1. Lysis Buffer
0.32M	Sucrose	5.47 g
5 mM	CaCl2	250 µl
3 mM	Mg(Acetate)2	150 µl
0.1 mM	EDTA	10 µl
10mM	Tris-HCl, pH8	500 µl
1 mM	DTT	17 µl
0.1%	Triton X-100	50 µl
Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water

2. Sucrose Solution
1.8 M	Sucrose	30.78 g
3 mM	Mg(Acetate)2	150 µl
1 mM	DTT	17 µl
10 mM	Tris-HCl, pH8	500 µl
Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water

3. Dounce buffer
10 mM	Tris	0.242 g
4 mM	MgCl2	0.163 g
1 mM	CaCl2	0.03 g
Adjust pH to 7.5 and volume to 200 ml with Autoclaved water