İnsan Postmortem Beyin Dokusu Nöronal Çekirdekler İzolasyon
Summary
Beyin dokusunda hücresel heterojenite testlerin çoğu tek hücreli çözünürlük eksikliği nedeniyle kromatin epigenetik işaretlerin çalışma için önemli bir sınırlama teşkil etmektedir. Nöronlar genellikle glia ve diğer non-nöronal hücreler ile iç içe. Biz özü ve insan beyninin nöron çekirdekleri toplamak için bir protokol sağlar.
Abstract
Insan beyninin nöron prenatal gelişimi sırasında büyük ölçüde postmitotic hale gelir, ve böylece tam ömrü boyunca çekirdekleri korumak. Ancak gelişme ve yaşlanma ders sırasında nöronal kromatin ve nükleer organizasyon değişiklikleri veya kronik nöropsikiyatrik hastalık hakkında bilinen çok az. Ancak bugüne kadar, en Kromatin ve DNA tabanlı testlerin (FISH dışında) eksikliği, tek hücreli çözünürlük. Nöronların genellikle çeşitli alt popülasyonlar glia ve diğer non-nöronal hücrelerin farklı türleri ile iç içe, çünkü bu amaçla, beyin dokusu önemli hücresel heterojenite, önemli bir sınırlama teşkil etmektedir. Hücre türüne özgü kültürleri büyümeye olası bir çözüm olurdu, ama nöronlar da dahil olmak üzere en çok merkezi sinir sistemi hücreleri, sadece birkaç hafta için, en azından, sürdürülebilir ex vivo ve böylece potansiyel olarak tam ömrü boyunca faaliyet epigenetik mekanizmalar için eksik bir model sağlayacak . Burada, (sabit asla) dondurulmuş insan postmortem beyin çekirdeklerinin özü ve arındırmak için bir protokol sağlar. Bu yöntem, anti-neun antikor ile Ultrasantrifügasyon ve immunotagging takip Hipotonik lizis tamponu çekirdeklerinin çıkarılması içerir. Etiketli nöronal çekirdeklerinin daha sonra floresan aktive sıralama kullanılarak ayrı toplanır. Bu yöntem, türlerin geniş bir yelpazede herhangi bir beyin bölgesi için geçerli olup, site ve modifikasyon özgü anti-histon antikorlar ve DNA metilasyon ve diğer testleri ile kromatin immunoprecipitation çalışmalar için uygun olmalıdır.
Protocol
Discussion
Burada sunulan protokol daha genel nöronal kromatin epigenetik değişiklikler ve odaklanmış çalışmaları için özellikle yararlı olacaktır, normal gelişmekte olan ve yaşlanma veya nörolojik veya psikiyatrik bir hastalık sırasında nöronal çekirdeği, moleküler fenotipi. Bu yöntem, potansiyel yaşlanma seyri sırasında nöron glia rasyon vardiya veya hastalık nedeniyle beyin dokusunda hücresel heterojenite bir endişe 1 belli bir avantajdır . Örneğin, bugünkü sıralama protokolü kromatin immunoprecipita…
Acknowledgements
Yazarlar Sitometrisi Core tesiste Massachusetts Üniversitesi Tıp Fakültesi Dr. Richard Konz ve personel tarafından sağlanan danışmanlık ve teknik destek için teşekkür ederiz. Diyabet Endokrinoloji Araştırma Merkezi Hibe DK032520 tarafından desteklenen temel kaynakları da kullanılmıştır. Bu çalışma, Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü (NIMH), Ulusal Uyuşturucu Enstitüsü'nden (NIDA) ve Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Enstitüsü hibe tarafından desteklenmektedir.
Materials
Reagents:
| 1. Lysis Buffer | ||
|---|---|---|
| 0.32M | Sucrose | 5.47 g |
| 5 mM | CaCl2 | 250 µl |
| 3 mM | Mg(Acetate)2 | 150 µl |
| 0.1 mM | EDTA | 10 µl |
| 10mM | Tris-HCl, pH8 | 500 µl |
| 1 mM | DTT | 17 µl |
| 0.1% | Triton X-100 | 50 µl |
| Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water | ||
| 2. Sucrose Solution | ||
|---|---|---|
| 1.8 M | Sucrose | 30.78 g |
| 3 mM | Mg(Acetate)2 | 150 µl |
| 1 mM | DTT | 17 µl |
| 10 mM | Tris-HCl, pH8 | 500 µl |
| Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water | ||
| 3. Dounce buffer | ||
|---|---|---|
| 10 mM | Tris | 0.242 g |
| 4 mM | MgCl2 | 0.163 g |
| 1 mM | CaCl2 | 0.03 g |
| Adjust pH to 7.5 and volume to 200 ml with Autoclaved water | ||
Riferimenti
- Siegmund, K. D., Connor, C. M., Campan, M., Long, T. I., Weisenberger, D. J., Biniszkiewicz, D., Jaenisch, R., Laird, P. W., Akbarian, S. DNA methylation in the human cerebral cortex is dynamically regulated throughout the life span and involves differentiated neurons. PLoS ONE. 2, 895-895 (2007).
- Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).
- Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. Retrospective birth dating of cells in humans. Cell. 122, 133-143 (2005).
- Acevedo, L. G., Iniguez, A. L., Holster, H. L., Zhang, X., Green, R., Farnham, P. J. Genome-scale ChIP-chip analysis using 10,000 human cells. Biotechniques. 43, 791-797 (2007).
