L'isolamento e la derivazione di cellule embrionali del mouse Germinal

Ciao, mi chiamo Har Moreno del Laboratorio di Genetica Riproduttiva e Cellule Staminali della Mississippi State University. Ciao, mi chiamo Clara St.Also per il laboratorio di genetica riproduttiva e cellule staminali della Mississippi State University. Le cellule germinali premortali o PGC sono i progenitori dell'armonia e della voia rispettivamente nel testicolo ovarico.

In embrioni di topo. Le PGC migrano dall'intestino della testa e attraverso la cresta genitale a 8,5-9,5 giorni. I PGC postum arrivano alla cresta genitale tra le 10,5 e le 11,5.

TA Postum e iniziano a formare la portata gonadica nella femmina D. I pg cs migrano verso l'estremità colaterale del rene per iniziare a formare la portata gonadica femminile. Al contrario, nei maschi, le PGC migrano su entrambi i lati della vescica.

Per iniziare a formare. Le cellule Ger maschili alridge sono un eccellente modello di ricerca per studiare le vie di sviluppo onico in presenza di stress ossidativo come causa di infertilità e cancro. Quindi iniziamo.

Oggi ti mostreremo come raccogliere e isolare i PV C dalle creste gonadiche in via di sviluppo a 10,5-11,5 giorni Le creste gonadiche degli embrioni di topo postum vengono dissociate dalla distruzione meccanica per impiantarsi sullo strato della figura dei fibroblasti dell'embrione della bocca. Dopo 10 giorni di coltura in condizioni ottimizzate, le colonie germinali embrionali mostreranno fenotipi embrionali. Anche dopo i passaggi possono essere identificati dalla loro espressione di potenti marcatori di cloro.

Per questa fase della dissezione sterile sono necessari i seguenti materiali. Confezione che contiene campi sterili, pinze, forbici, lame di rasoio, saponi antimicrobici, soluzioni saline, piastra di Petri riempita con PBS Pep su ghiaccio e garza una gravidanza cinque sette BL sei bocca femminile a 10,5 a 11 giorni, Postum viene soppresso per lussazione cervicale. Pulisci l'addome con sapone antimicrobico, quindi rasalo dopo.

Lavare l'addome con soluzioni saline. Asciugalo con una garza sterile. Copri il mouse con un nuovo campo sterile.

Fai un'incisione ventrale usando una pinza e seziona alcune forbici. Identificare e rimuovere l'intero utero dalla cavità addominale. Gli embrioni della bocca saranno visibili all'interno dell'utero.

Con molta attenzione. Mettere attraverso i legamenti che sono ancora attaccati al corno uterino. Completare la dissezione praticando un taglio trasversale lungo la vagina.

Trascrivere l'utero su una capsula di Petri, sigillare con GPVS e tenerlo in ghiaccio. Separare i tessuti extraembrionali dagli embrioni della bocca. Utilizzando un bisturi e una pinza sterili.

Trasferisci gli embrioni della bocca in una capsula di Petri fresca riempita con DPBS. Lunghezza misurabile dell'embrione della bocca. Abbiamo scoperto che le dimensioni differivano a seconda dell'età dell'embrione.

Ad esempio, 8,5 giorni dopo il ciclo di vita misurati in media sei millimetri, 10,5 giorni dopo il ciclo di vita misurati in media 11 millimetri e 12,5 giorni dopo il ciclo di vita misurati in media 16 millimetri. Rimuovere le loro code attraverso l'estrazione del DNA. Per lo stereomicroscopio di dissezione sono necessari i seguenti materiali: cassetta di biosicurezza PDS, bisturi sterile.

Pinze fini sterili, ago per stuzzicare fine sterile con manico in fogli di carta da filtro per dischi di Petri. Metti una carta da filtro in una capsula di Petri, quindi posiziona l'embrione della bocca sopra la carta da campo per asciugare l'embrione e immobilizzarlo per la dissezione. Utilizzando un bisturi sterile, eseguire un taglio trasversale dell'embrione della bocca sopra l'origine del cordone ombelicale al microscopio stereoscopico.

Utilizzo di pinze fini sterili in un ago da stuzzicamento fine sterile. Rimuovere l'intestino e il fegato in modo che il sistema urinario sia visibile. La vescica si trova su un piano mediale.

L'embrione può essere identificato come maschio perché i ponti gonadici si trovano su entrambi i lati della vescica. Utilizzando una pinza fine sterile in un ago sottile sterile, rimuovere la cresta della gona maschile destra tagliando via il tessuto che la sostiene. Usa la stessa procedura per rimuovere la cresta genitale maschile sinistra.

Trasferire entrambe le creste genitali maschili in una piccola capsula di Petri contenente microscopicamente DPDS freschi. È possibile visualizzare la cresta gonadica maschile attaccata al tutore per il miso. Le creste delle gone maschili dovrebbero essere a strisce grandi e di forma ovale sotto uno stereomicroscopio.

Rimuovere l'intestino utilizzando una pinza fine sterile e un ago da presa fine sterile. I reni si trovano lateralmente nella cavità addominale e la vescica si trova più medialmente e codale rispetto al rene. La cresta gonadica femminile è diversa dalla cresta gonadica maschile a causa della sua morfologia e posizione anatomica.

Le creste gonadiche femminili sono saldamente attaccate all'estremità laterale codale del rene. Utilizzando una pinza fine sterile e un ago sottile sterile. Rimuovere la cresta della gona femminile sinistra tagliando via i tessuti che la attaccano al rene.

Ripetere la stessa procedura per rimuovere la cresta gonadica femminile destra. Trasferire entrambe le creste genitali femminili in una piccola capsula di Petri contenente PDS fresco al microscopio. È possibile visualizzare la cresta gonadica maschile attaccata alla Neso Nera.

Queste femmine dovrebbero essere macchiate con una forma allungata ed essere più piccole rispetto alle creste maschili che utilizzano aghi sterili, sottili e affilati. Separare le creste della gona femminile dal meso e da altri tessuti somatici utilizzando aghi sterili, sottili e affilati. Separare le creste gonadiche maschili dal meso nero e da altri tessuti somatici.

È importante rimuovere il meso Neros dalla cresta del Natal perché è un tessuto somatico che crescerà eccessivamente nel processo di derivazione della PGC. Raccogliere la cresta gonale in una goccia da 0,5 microlitri di DPVS fresco con soluzioni di disgusto alla collagenasi. Al microscopio stereoscopico, i tessuti delle gonadi vengono tagliati in piccoli pezzi utilizzando aghi sterili sottili e affilati.

Le piastre di Petri vengono trasferite in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Dopo 15 minuti, il tessuto può essere dissociato mediante pipettaggio utilizzando pipette capillari in vetro con diametri diversi tra 40 e cento micron. Rompere i pezzi pipettandoli su e giù.

Questo formerà piccoli crolli. Questi piccoli grumi vengono lavati in 0,5 microlitri di DPDX dopo il lavaggio. Questi vengono trasferiti ai cubi Eend a 2000 giri/min per cinque minuti.

A temperatura ambiente dopo il centesimo di fu, il surnatante viene rimosso e il pellet viene strappato in 0,5 millilitri di mezzo knockout integrato senza riscaldamento a 37 gradi Celsius per 24 ore. Prima di questo processo, è necessario preparare un microacido di fibroblasti della bocca inattivata metanfetamina uno strato di alimentazione immediatamente prima di placcare il PGC. I mezzi di massa devono essere rimossi dallo strato di alimentazione di massa preparato.

Quindi aggiungere millilitri di millilitri di terreno knockout integrato precedentemente riscaldato a 37 gradi Celsius sullo strato di alimentazione della metanfetamina. Sotto stereomicroscopi che utilizzano una distribuzione simmetrica, piccole pompe di PT GC vengono piastrate sopra gli strati di alimentazione della metanfetamina. Se questi pezzi sono vicini, tendono ad aggregarsi e a formare colonie dense che si attaccano male o iniziano a differenziare la cultura.

Le piastre devono essere etichettate con il nome della linea cellulare germinale embrionale, il numero di passaggio e la data. Trasferire con cura le piastre di coltura in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di COC dopo 10 giorni dall'isolamento, è possibile identificare le colonie di cellule germinali embrionali in base alla loro morfologia caratteristica. Inoltre, dopo il primo passaggio, possono essere identificati dalla loro espressione di potenti marcatori influenzali come l'alfa lime fosfatasi, OP quattro SSEA uno e così due volte.

Oggi ci siamo appena uniti a voi Come collezionare insolate e cultura. Cellule germinali embrionali da PGC come post 10,5 11,5 giorni. La caratterizzazione delle cellule germinali embrionali come precursori della carne di GA è essenziale per il recesso correlato alla gametogenesi nella fertilità e nel cancro.

Grazie per aver guardato il nostro video. Buona fortuna per il tuo esperimento.