Forno a microonde Assist diagnosi rapida di malattie virali piante da microscopia elettronica a trasmissione

L'obiettivo generale di questa procedura è diagnosticare le malattie dei virus delle piante entro poche ore mediante microscopia elettronica a trasmissione. Questa procedura inizia con la fissazione assistita da microonde e l'incorporazione del materiale vegetale infetto. Il passo successivo consiste nell'estrarre e colorare le particelle virali dai campioni di piante mediante colorazione negativa, seguita dal sezionamento dei campioni di piante incorporati.

I campioni vengono quindi esaminati nel microscopio elettronico a trasmissione e la dimensione delle particelle virali viene misurata mediante analisi delle immagini. In definitiva, i risultati mostrano le tipiche alterazioni ultrastrutturali indotte dai virus e le dimensioni delle particelle virali attraverso metodi di microscopia elettronica a trasmissione. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la fissazione convenzionale e l'inclusione a temperatura ambiente, che possono richiedere diversi giorni, è che il tempo di preparazione del campione per la microscopia elettronica a trasmissione può essere ridotto a circa due ore, consentendo così una diagnosi chiara della malattia virale in circa mezza giornata.

A dimostrare questa procedura insieme a me saranno Gerhard Kaba, un tecnico e il professor Zelnik, un collega del nostro laboratorio Prima dell'inizio del programma di preparazione del campione, il processatore automatico di tessuti a microonde per microscopia elettronica LA A-E-M-A-M-W con i protocolli appropriati. Preparare le soluzioni per le diverse fasi descritte nel protocollo programmato per la fissazione, la disidratazione e l'infiltrazione e riempirle nelle fiale designate secondo il protocollo, caricare le fiale sulla giostra. Inserire il carosello nel processatore di tessuti a microonde, quindi caricare la prima fiala nella camera monomodale.

Quindi, ritaglia piccole sezioni di foglie dal tabacco nicotiana infettato dal virus del mosaico del tabacco o TMV con una lama di rasoio su una lastra di cera da modellare in una goccia di glutaraldeide in sorens e tampone fosfato a temperatura ambiente. Durante la raccolta dei campioni e il caricamento dei campioni nei cestelli, è importante assicurarsi che siano sempre coperti con una soluzione fissativa in modo che non provino l'uso di pinzette sottili. Trasferire immediatamente le sezioni negli appositi cestelli con una larghezza di maglia di circa 200 micrometri.

Impilare i cestelli uno sopra l'altro e inserirli nella camera in modalità mono. Avviare il protocollo di preparazione del campione assistito da microonde precedentemente programmato per la fissazione, la disidratazione e l'infiltrazione. Poco prima che il protocollo di preparazione del campione giunga al termine, riempire la resina epossidica agar 100 appena preparata nelle forme di polimerizzazione designate.

Al termine del protocollo, rilasciare i cestelli impilati contenenti i campioni infiltrati dalla camera monomodale nell'ultima fiala del carosello. Rimuovere la giostra dal dispositivo a microonde e prelevare la fiala contenente i campioni dalla giostra. Quindi rimuovere i cestelli dalla fiala e disimpilarli con una pinzetta fine.

Caricare i campioni nelle forme di polimerizzazione designate. Successivamente, impilare le forme di polimerizzazione una sopra l'altra e rimuovere le fiale precedentemente utilizzate dal carosello del processore di tessuti a microonde. Caricare la giostra con i cestelli impilati e inserire la giostra nel dispositivo a microonde.

Avviare ora il protocollo di polimerizzazione precedentemente programmato. Al termine del protocollo, rimuovere le forme di polimerizzazione dalla camera monomodale e disimpilarle. Rimuovere i blocchi polimerizzati contenenti i campioni, che sono ora pronti per il sezionamento con un microtomo per iniziare la procedura di sezionamento dei blocchi contenenti i campioni.

Inserire uno o più blocchi in portacampioni separati per un taglio ultra sottile. Con il campione in cima, sporgendo di circa un centimetro dal supporto. Rifilare il blocco con un tagliacampioni per TEM in modo da ottenere una superficie del blocco di un massimo di un millimetro di lunghezza e 200 micrometri di larghezza contenente quanto più materiale fogliare possibile.

Impostare l'ultra microtomo per tagliare sezioni di circa 70-90 nanometri di spessore a una velocità di taglio di circa un millimetro al secondo. Sezionare il blocco utilizzando un coltello diamantato con un angolo di 45 gradi. Prelevare più sezioni con un palo a griglia a maglia quadrata in rame o nichel rivestito VAR 200 macchiare le sezioni sulla griglia con citrato di piombo per cinque minuti in una capsula di Petri, parzialmente riempita con NAOH per creare un ambiente privo di CO2.

Lavare le griglie con acqua distillata per un minuto. Infine, post-macchiare per 15 minuti con acetato di orinatoio all'1% sciolto in acqua distillata a temperatura ambiente dopo aver lavato le griglie con acqua distillata per un minuto, asciugare all'aria in una scatola a griglia. La colorazione negativa del materiale vegetale rimanente viene eseguita mentre la preparazione del campione viene eseguita automaticamente dal processatore di tessuti a microonde.

Innanzitutto, raccogli circa 100 milligrammi di materiale fogliare infetto da TMV e prepara la SAP grezza omogeneizzando il materiale per due minuti con una lama di rasoio al microscopio. Inserire il sorens e il tampone fosfato. Trasferire 20 microlitri dell'omogeneizzato risultante sul primo pozzetto di un microscopio rivestito in teflon.

Scivolo con quattro o più pozzetti. Quindi posizionare una griglia rivestita di forma VAR sopra l'omogeneizzato con il lato rivestito di forma VAR rivolto verso la goccia di incubazione per cinque minuti. Lavare la griglia per due minuti posizionandola sopra una goccia di sorens e tampone fosfato.

Ripetere il lavaggio per altri due minuti. Quindi, incubare la griglia per un minuto con una soluzione acida di stick di lingua fosfo appena preparata. Dopo un minuto, rimuovere la griglia e lasciarla asciugare all'aria.

In una scatola a griglia, caricare la griglia colorata negativamente nel portacampioni ed esaminarla con un microscopio elettronico a trasmissione. Mentre la polimerizzazione viene eseguita automaticamente dal processore di tessuti a microonde, scattare almeno 10 immagini di ioni colorati negativamente scelti a caso. Almeno 10 o più ioni dovrebbero essere visibili su ogni immagine.

Con il microscopio elettronico a trasmissione con un ingrandimento primario di 21.000 x o superiore, è necessario prestare attenzione che tutte le immagini abbiano lo stesso ingrandimento. Anche le sezioni contenenti i campioni di tessuto che sono stati processati automaticamente dal processatore di tessuti a microonde vengono esaminate con un microscopio elettronico a trasmissione. L'analisi delle immagini acquisite da TEM può essere eseguita utilizzando qualsiasi analisi di immagine.

Software per computer con uno strumento di analisi delle particelle. Misurare la lunghezza e le dimensioni di almeno 100 singole particelle virali scelte a caso sulle micrografie prelevate dai campioni colorati negativamente. Calcolare le medie e le deviazioni standard per ottenere una lunghezza e una larghezza medie delle particelle virali visualizzate con metodi di colorazione negativa e TEM dopo la preparazione del campione assistita da microonde.

Tipiche alterazioni ultra strutturali indotte da TMV, come grandi aree contenenti ioni allineate in forma parallela, potrebbero essere osservate con il microscopio elettronico a trasmissione nel citosol di cellule di tabacco nicotiana infette. In questa micrografia elettronica a trasmissione C rappresenta il cloroplasto con l'amido. St.M sta per mitocondrio ed è per nucleo, e V sta per vacuolo.

Inoltre, nel SAP grezzo delle foglie infette da TMV, le particelle di TMV potrebbero essere osservate come strutture a forma di bastoncino dopo la colorazione negativa. Questo grafico mostra la distribuzione relativa della lunghezza e della larghezza di 100 particelle TMV così come apparivano al microscopio elettronico. Dopo la colorazione negativa, l'analisi dell'immagine delle foglie infette delle particelle virali ha rivelato una dimensione media per TMV di 280 nanometri di lunghezza e 17 nanometri di larghezza Dopo il suo sviluppo per diagnosticare rapidamente le malattie virali cerebrali.

Questa tecnica può aprire la strada ai ricercatori nel campo della patologia animale e umana per diagnosticare rapidamente le malattie animali e umane mediante microscopia elettronica a trasmissione.