Misurazione della carica batterica e Risposte immunitarie in topi infettati con Listeria monocytogenes

Questo video mostra un metodo per misurare la carica batterica e generare e analizzare sospensioni di singole cellule da topo, fegato e milza. In primo luogo, viene preparato un inoculo di listeria che viene iniettato per via endovenosa nei topi. Il sangue, il fegato e la milza vengono quindi raccolti da topi soppressi in momenti prescelti.

Le sospensioni a cellula singola sono preparate da tessuti raccolti e omogeneizzati di tessuto AC coltivati su piastre di agar di sangue di cavallo. Le sospensioni cellulari risultanti possono quindi essere analizzate per verificarne la vitalità e il contenuto di cellule immunitarie mediante analisi via fax, mentre la carica batterica viene determinata in base alle unità formanti colonie. Questo metodo può aiutare a caratterizzare le risposte immunitarie all'infezione da steroidi, come quelle tra ceppi di mali suscettibili e resistenti, determinando contemporaneamente la carica batterica negli organi infetti.

Iniziare questa procedura preparando l'inoculo di listeria alla concentrazione desiderata Le istruzioni per la coltivazione, la conservazione e la preparazione della listeria sono riportate nel protocollo scritto allegato. Una volta che l'inoculo è pronto, trasferire due aliquote da 100 microlitri in provette micro fuse sterili contenenti 900 microlitri di PBS per ottenere una diluizione da uno a 10, quindi trasferire 100 microlitri di ciascuna diluizione in piastre HBA di agar di sangue di cavallo e distribuire accuratamente con uno spandiconcime sterile per eseguire i conteggi delle CFU dell'unità formante colonie, quindi incubare le piastre capovolte a 37 gradi Celsius durante la notte. Quindi, trasferisci i topi in una gabbia pulita.

Posiziona la gabbia a 50 centimetri sotto una lampada a infrarossi da 250 watt per cinque minuti per assicurarti che la vena della coda sia dilatata. Ciò consente una migliore visualizzazione durante l'iniezione qui, il ceppo di topo resistente alla listeria, C 57 black six, e il ceppo di topo sensibile alla listeria. La valvola C verrà iniettata mescolando delicatamente la sospensione di listeria invertendo il tubo alcune volte.

Quindi caricare una siringa da un millilitro con un ago iniettabile calibro 27 da 200 microlitri per topo. Assicurarsi che eventuali bolle d'aria all'interno della siringa vengano espulse prima dell'iniezione. Posizionare il mouse in un dispositivo di ritenuta.

Quindi individua la vena laterale della coda del topo identificando prima l'arteria della coda, che si trova al centro del lato dorsale. Quindi ruotare leggermente la coda sul lato laterale per identificare la vena. Strofinare delicatamente la coda con un panno all'etanolo al 70%, quindi iniettare dopo aver estratto la siringa.

Applicare brevemente una pressione sulla ferita d'ingresso con una garza quadrata sterile. Si noti che è molto più difficile identificare la vena caudale nei topi di colore nero dopo l'iniezione. Rimetti il topo nella sua gabbia dopo aver iniettato tutta la piastra dei topi e incuba l'inoculo rimanente per il conteggio delle unità formanti colonie.

Come prima del giorno successivo, contare il numero di colonie e determinare le concentrazioni pre e post iniezione dell'inoculo di listeria. L'alone caratteristico che circonda le singole colonie, come mostrato qui, è dovuto all'emolisi beta. Una volta determinati i conteggi pre e post-iniezione, calcolare le unità medie formanti colonie sommando i conteggi delle unità formanti colonie pre e post-iniezione e dividendo per due.

Infine, in vari momenti dopo l'iniezione, raccogliere il sangue e prelevare il fegato e la milza dai topi soppressi. Se verrà eseguita l'analisi via fax, il fegato deve essere perfuso prima della rimozione per ottenere il sangue, eseguire un'emorragia cardiaca subito dopo l'eutanasia e raccogliere quanto più sangue possibile in un'apposita provetta di raccolta. Per perfondere il fegato, per prima cosa, aprire la cavità addominale e rimuovere e scartare la cistifellea.

Lo speleologo interno della vena è una vena che corre parallela alla colonna vertebrale e trasporta il sangue dalla parte inferiore del corpo, compreso il fegato, al cuore. Usando un paio di forbici, servire la vena appena sotto il cuore per creare uno sbocco per l'uscita del liquido di perfusione. Quindi, capovolgi i lobi del fegato verso la testa e spingi l'intestino verso destra per esporre la vena porta epatica, che alimenta il fondo del fegato.

Dal lato inferiore destro, inserire un ago piegato da 26 gauge di mezzo pollice di lunghezza nella vena porta epatica e iniettare 10 millilitri di PBS. Dopo che sono stati iniettati uno o due millilitri di PBS, il fegato passerà da un colore rosso scuro a marrone chiaro. La soluzione iniettata uscirà dallo speleologo della vena inferiore reciso La perfusione epatica assicura che le cellule raccolte provengano dal fegato e non dal sangue circolante.

Quindi, rimuovere il fegato perfuso dalla cavità corporea del topo e immergerlo nel tubo di tampone su ghiaccio. Quindi rimuovere la milza e metterla sul ghiaccio per la lavorazione in modo simile a come descritto nella sezione successiva. Affinché il fegato generi singole sospensioni di cellule epatiche, iniziare trasferendo il fegato perfuso dal tampone fax a un colino cellulare da 70 micron posizionato all'interno di una capsula di Petri da 60 millimetri.

Usando uno stantuffo della siringa da cinque litri, spingere il tessuto attraverso il colino cellulare nella capsula di Petri. Trasferire la sospensione a cella singola in un tubo con tappo a vite conico da 50 millilitri e portare il volume totale a 40 millilitri. Con buffer fax a freddo.

Vortice la sospensione cellulare. Quindi mettere da parte un'aliquota quata da un millilitro per la determinazione della carica batterica. Più avanti nella procedura, posizionare la provetta da 50 millilitri nella centrifuga e pellettare le celle ruotando 500 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo aver scartato il supinato, ripetere questa fase di lavaggio sospendendo il pellet in 40 millilitri di tampone fax freddo e centrifugando. Ancora una volta, resus. Sospendere il pellet in 20 millilitri di isotonico per foro a temperatura ambiente, centrifugare la sospensione cellulare a 700 volte G per 12 minuti a temperatura ambiente.

Dopo la rotazione, un foglio di epatociti simile a un disco galleggerà sopra il perolo e i leucociti si ripeteranno pellettati sul fondo del tubo, scarteranno lo strato di epatociti e il perolo versandolo in un contenitore per rifiuti. Quindi sospendere il pellet contenente leucociti in quattro millilitri di tampone TAC agli eritrociti Liz e incubare le cellule a temperatura ambiente per un massimo di 10 minuti con frequenti inversioni. Dopo l'incubazione, filtrare la sospensione cellulare attraverso una membrana di nylon da 100 micron in una nuova provetta da centrifuga da 10 millilitri.

Applicare la sospensione cellulare filtrata con un millilitro di tampone EDTA fax come mostrato di seguito. Quindi centrifugare a 350 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifuga, riprendendo la piegatura di cinque millilitri di tampone EDTA fax, quindi centrifugare di nuovo e inviare nuovamente il pellet in 0,5-3 millilitri di fax, tampone EDTA, a seconda delle dimensioni del pellet, determinare il numero di leucociti epatici vitali utilizzando un emocitometro basato sul fegato di esclusione blu triam.

Le sospensioni di singole cellule possono quindi essere marcate con anticorpi specifici per i marcatori di superficie cellulare desiderati e analizzate in base ai fatti. Una volta che le sospensioni di singole cellule sono state generate dal fegato e dal tessuto della milza, verranno determinate le cariche batteriche per alcune parti della procedura. Verrà utilizzata una macchina per omogeneizzare il tessuto tenendo chiusa una sacca del pronto soccorso dello stomaco per evitare perdite.

Inizia appoggiandolo su una panca pulita. Arrotolare una penna rotonda spessa sul fazzoletto fino a quando il fazzoletto non viene schiacciato all'interno della borsa. Aggiungere cinque millilitri di PBS a ciascuna sacca di cocco gastrica contenente tessuto schiacciato.

Posiziona lo stomaco o le sacche nello stomaco e corri ad alta velocità per 10 minuti. La macchina per lo stomaco ha due pale che premono lo stomaco o le sacche a una velocità specificata, miscelando il contenuto in un omogeneizzato uniforme e contenendo eventuali aerosol utilizzando una pipetta, mescolare l'omogeneizzato nella sacca. Quindi trasferire 300 microlitri in duplicato su una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti.

All'interno dei pozzetti della piastra a 96 pozzetti, eseguire una diluizione seriale da 1 a 10 a una diluizione da 10 a cinque. Per ogni campione di omogeneizzato tissutale, utilizzare con cautela uno spalmatore sterile per distribuire 0,1 millilitri di ciascuna diluizione su una piastra HBA pre-essiccata. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius durante la notte.

Il giorno successivo, contare il numero di unità formanti colonie per ogni diluizione e calcolare le unità formanti colonie per tessuto tenendo conto della porzione dei fattori di diluizione tissutale e del volume dell'omogeneizzato. Vedi se i topi neri C 57 sono stati infettati con circa 2000 unità formanti colonie di listeria a tre e sette giorni dopo l'infezione, i topi sono stati soppressi e il fegato è stato perfuso e raccolto con la milza. La diluizione dell'omogenato splenico o la sospensione epatica a singola cellula sono state coltivate su piastre HBA per determinare la carica batterica.

Nei risultati mostrati qui, la linea tratteggiata indica il limite di rilevamento a 100 unità formanti colonie per organo. Si noti che il carico di listeria è più alto al terzo giorno rispetto al settimo giorno. Questo perché entro il settimo giorno, varie cellule immunitarie portano all'eliminazione della listeria.

In questi due tessuti, milza e fegato, le sospensioni di singole cellule sono state colorate con blu trian e caricate su un emo. Verranno contate le cellule del citometro all'interno dell'area di conteggio indicata nella casella rossa. Le cellule non vitali assorbiranno il triam blu e appariranno blu, mentre le cellule vitali rimarranno non colorate.

Come mostrato qui, il numero di cellule vitali nella milza mostrate a sinistra e il numero di leucociti vitali nel fegato mostrati a destra aumentano durante il corso dell'infezione. Questo aumento è dovuto alle cellule immunitarie, compresi i neutrofili e i linfociti, che si attivano, proliferano e migrano verso questi due siti di infezione. Come esempio dei livelli di cellule immunitarie durante il corso dell'infezione da listeria, qui sono mostrati i grafici fax rappresentativi e il numero di cellule T positive CD otto.

Il numero di cellule T positive CD eight diminuisce transitoriamente a causa della linfopenia nella milza al secondo o terzo giorno prima di aumentare notevolmente dal quinto giorno dopo l'infezione sia nella milza che nel fegato. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'oscillazione degli androgeni, le cellule T antigene specifiche e i saggi funzionali di cellule immunitarie selezionate per caratterizzare ulteriormente le risposte immunitarie all'infezione da listeria.