Isolement des cellules épithéliales mammaires à partir de trois dimensions de cellules mixtes Sphéroïde Co-culture

L’objectif global de cette procédure est de dériver des cellules épithéliales à partir de cultures de tissus cellulaires mixtes tridimensionnels afin d’analyser les effets des fibroblastes stromaux sur la biologie des cellules épithéliales. Ceci est accompli en établissant d’abord des co-cultures de stéroïdes à cellules mixtes tridimensionnelles. Les sphe sont ensuite séparés de la culture matricielle afin d’isoler les cellules épithéliales post-co-culture.

L’étape suivante consiste à faire passer les cellules épithéliales post-co-culture jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour l’analyse. En fin de compte, les effets de l’exposition aux fibroblastes en culture tridimensionnelle sur le comportement des cellules épithéliales peuvent être évalués par imagerie microscopique des cultures et analyse de la post-co-culture. Les cellules épithéliales, telles que l’imagerie par fluorescence de l’invasion matricielle et la migration Transwell comme montré ici, démontrant la procédure sera Quin, un associé de recherche de mon laboratoire La veille, établissant les co-cultures.

Sortez le gel de matre du congélateur et décongelez-le sur de la glace dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le jour de l’expérience, placez le milieu de culture sur de la glace au moins une heure avant de le mélanger avec le gel de matra. Pour diluer le gel de matra décongelé.

Ajouter la moitié du volume de milieu H Mac glacé nécessaire à la co-culture dans un tube stérile sur glace. Ajoutez ensuite la même moitié du volume total de matrigel décongelé dans le tube pour obtenir une dilution un à un, en gardant le tube sur de la glace. Ensuite, 50 microlitres de mélange de milieu de gel matra au milieu du puits dans des puits désignés d’une plaque de 24 puits et incuber la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec de l’air humidifié et 5 % de CO2 pendant 10 minutes.

Ajoutez ensuite 450 microlitres supplémentaires de mélange de gel matra dans les puits et incubez pendant 60 minutes supplémentaires. Au cours de la deuxième incubation, préparer une suspension individuelle de fibroblastes et de cellules épithéliales à une concentration de 0,5 fois 10 à la cinquième cellule dans chaque 0,5 millilitre de milieu Hme. Lorsque le mélange de milieu matrigel s’est solidifié, déposez doucement la suspension cellulaire sur le dessus du gel et remettez la culture dans l’incubateur pendant deux jours.

Changez de milieu tous les deux à trois jours en aspirant très doucement le milieu par le côté du puits et en le remplaçant doucement par une formation de sphéroïde fraîche du moniteur de support HEC quotidiennement sous l’image du microscope, le cas échéant, en utilisant la microscopie optique ou fluorescente. Commencez par pipeter la culture de haut en bas 10 fois à l’aide d’une pipette en verre stérile de deux millilitres. Ensuite, transférez la culture avec la pipette en verre dans un tube à centrifuger stérile de 15 millilitres et centrifugez pendant 10 minutes à 350 fois G à température ambiante après centrifugation, le stéroïde cellulaire sédimentera au fond du tube.

À l’aide d’une pointe de pipette de pâturage stérile, vous pouvez retirer délicatement le gel de matra perturbé du haut de la centrifugeuse. Préparation. Ajoutez maintenant un millilitre de milieu H mac à la pipette stéroïde granulée de haut en bas deux à trois fois avec une pipette en verre stérile de deux millilitres et transférez la culture dans un puits dans une plaque de culture tissulaire de 24 puits. Laissez le stéroïde se fixer sur le plat pendant au moins 48 heures avant de changer de support.

Au fil du temps, les cellules quitteront la structure sphéale et se développeront en monocouches après que les cultures cellulaires auront atteint 50 % de confluence, les passeront à l’aide d’un protocole de standardisation dans une boîte de 35 millimètres pendant deux à quatre jours, puis passeront à une boîte de 100 millimètres pendant trois à cinq jours avant une analyse plus approfondie des cellules. À l’aide d’une pipette de pâturage stérile, aspirez le milieu, puis retirez manuellement autant de sphéroïdes fantômes résiduels que possible. Dans les co-cultures de sphéroïdes tridimensionnels, les fibroblastes avec TM modifié, le silençage un, comme démontré ici dans les figures d, E et F, induisent une invasion accrue de la matrice par les cellules épithéliales à mémoire par rapport aux fibroblastes témoins des figures A, B et C.Notez que les projections épithéliales envahissant la matrice dans les sphéroïdes incorporant des fibroblastes silencieux de TM un, comme indiqué par les flèches dans les figures D et F, des fibroblastes avec une surexpression modifiée de TM one illustrés ici dans les figures JK et L induit une diminution de l’invasion par la lignée cellulaire du cancer du sein somme 1 59 par rapport aux fibroblastes témoins dans les figures GH et je compare l’absence de projections épithéliales dans les stéroïdes incorporant des fibroblastes modifiés par TM One avec ceux incorporant des fibroblastes de contrôle indiqués par les flèches dans les figures G et i une fois que les stéroïdes de co-culture ont été établis.

Les populations cellulaires peuvent être isolées des stéroïdes par replacage dans un contexte bidimensionnel. Ce composite d’images montre des cultures sous microscopie à lumière et à fluorescence après leur isolement de la culture matrigel ici. Le jour zéro représente l’imagerie immédiatement après l’isolement Les jours un, deux et cinq indiquent les jours après l’isolement.

Notez comment la couronne de cellules quittant ce stéroïde augmente avec le temps. Finalement, un stéroïde fantôme avec très peu de cellules reste, comme le souligne ici la flèche. Très peu de stéroïdes restent après l’élimination des fantômes et un passage.

En fonction des taux de croissance relatifs des cellules testées. Les populations pures peuvent émerger par passage en série ou peuvent être triées à l’aide de marqueurs cellulaires appropriés. Dans cet exemple, les watts de l’échantillon sont analysés par cytométrie en flux, en utilisant la fluorescence verte et la fluorescence rouge pour identifier les fibroblastes exprimant la GFP et les cellules épithéliales exprimant respectivement la mCherry afin de déterminer les populations relatives de cellules épithéliales et de fibroblastes.

Après l’isolement à partir d’une co-culture 3D, les cellules épithéliales conservent les propriétés conférées par la co-culture avec des fibroblastes sur de longues périodes, ce qui permet de nombreuses possibilités d’analyse. Dans cet exemple, l’exposition à des fibroblastes déficients en TM One a induit une migration accrue dans les H max co-cultivés qui a persisté pendant des semaines après l’isolement de la co-culture 3D par rapport à l’exposition à des fibroblastes témoins étiquetés ici comme C suivant cette procédure. D’autres méthodes comme celles d’analyse des changements dans l’expression des gènes et les marques épigénétiques peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant les effets des fibroblastes sur les cellules épithéliales.