Visualización de G3BP estrés gránulos Dinámica en Pilas en directo

El objetivo general del siguiente experimento es estudiar la dinámica de los gránulos de ribonucleoproteínas en las células primarias, especialmente la formación de gránulos de estrés. Esto se logra cultivando primero células como neuronas de ratón, embrionarias, fibroblastos o del hipocampo de animales de interés. Como segundo paso, se transfecta un componente marcado de los gránulos de tensión para permitir su visualización.

A continuación, las células se inducen al estrés y se monitorizan con microscopía confocal time-lapse. Los resultados obtenidos muestran la dinámica de G, tres BP, uno que contiene gránulos de estrés, en mitos o neuronas espejo e hipocampales a partir de su visualización directa. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave sobre la respuesta al estrés en células como las neuronas.

Por ejemplo, en ratones, se encontraron defectos neuronales en la eliminación del ARN, proteínas que prohíben esenciales para los gránulos de estrés. Por lo tanto, este método puede ayudar a comprender los mecanismos detrás de estas observaciones. Después de sacrificar a una rata embarazada con E 13.5, desinfecte la rata con etanol al 90% y retire los cuernos uterinos debajo de una capucha estéril.

Transfiera los cuernos a 37 grados centígrados DPBS y retire los embriones. Transfiere los embriones a un plato de 100 milímetros. Retire el exceso de pañuelos y lávelos con DPBS tibio.

Ahora, bajo un microscopio, extirpe las extremidades, los órganos internos y la parte superior de la cabeza que contiene el cerebro. Las secciones de la cola o la cabeza se pueden utilizar para el genotipado. Pica los pañuelos restantes en un plato aparte durante al menos un minuto.

No combine los genotipos si deben variar dentro de la camada. Cubrir el tejido picado con una x tripsina EDTA e incubarlo durante 30 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, agregue 10 mililitros de medio mes completo.

Para detener la reacción, afloje el tejido con una pipeta y transfiera la suspensión resultante a un tubo de 50 mililitros. Cubra el tubo con medio y deje que el contenido se asiente. A continuación, decanta las celdas suspendidas.

A continuación, baje la suspensión a 300 G durante cinco minutos. A temperatura ambiente, reus, suspender el pellet en seis mililitros de medio completo por embrión. Un recuento de células nucleadas viables debería ser de alrededor de 5 millones por embrión.

A continuación, cargue placas de 60 milímetros con tres mililitros de suspensión celular y cultivo. Ellos. Cambie el medio al día siguiente y permita que las células crezcan hasta alcanzar la fluidez. Cuando las células se subcultivan, solo los fibroblastos sobreviven.

Divide las placas confluentes en vidrio de 35 milímetros. Platos de fondo. Cultive estos platos entre el 50 y el 70% de fluidez y proceda con la transfección.

Por cada plato de 35 milímetros, tenga tres microgramos de plásmido purificado para la transfección. Bastará con utilizar un kit de transfección disponible en el mercado. En este ejemplo, un vector que expresa la brecha de RA.

Se transfecta la proteína de unión a tres dominios SSH. Es un componente importante de los gránulos de estrés. El procedimiento es, por supuesto, aplicable al estudio de cualquier vector de interés en los fibroblastos el día antes de la recolección de la cría.

Prepare los platos recubiertos de lisina Pauline comience recolectando embriones de 18.5 madres DPC y transfiriéndolos a HBSS en un plato grande. Si se desea, se pueden sustituir las crías neonatas para evitar el sacrificio de la madre. Corta la cabeza y retira el cerebro.

Luego, recolecta los cerebros del cachorro en un plato limpio con HBSS bajo un microscopio. Retire todas las meninges con pinzas finas. A continuación, separe las partes deseadas del cerebro, como el hipopótamo.

Transfiera los pañuelos a 4,5 mililitros de HPSS frío en tubos de 15 mililitros y manténgalos en hielo. Digiera los tejidos añadiendo 0,5 mililitros de solución de tripsina al 2,5%. Incubarlos a 37 grados centígrados durante 15 a 20 minutos.

A continuación, enjuague la tripsina con tres lavados de HBSS, teniendo cuidado de no perder ningún tejido. Ahora vuelva a suspender los tejidos en medio a un mililitro de DMM con 10% de FBS. A continuación, homogeneice el tejido haciéndolo fluir a través de la pipeta.

A continuación, cambie a una punta de 200 microlitros y pipetee la solución hasta que no queden agregados visibles. A continuación, agregue de 100 a 200 microlitros de la suspensión de celdas a platos de vidrio de 35 milímetros con fondo preparados con medios DMM FBS para incubar los platos. Después de tres horas de cultivo, reemplace el medio con un medio completo de neurona precalentado durante el tiempo de cultivo restante.

Después de cinco a 14 días en cultivo, transfiera las neuronas utilizando el método del fosfato de calcio. 24 horas después de una transfección exitosa, los gránulos de estrés comenzarán a ensamblarse debido a la sobreexpresión de G tres BP. La tensión adicional inducirá aún más el ensamblaje de gránulos de tensión, precaliente los componentes del microscopio confocal durante al menos 20 minutos, incluido el calentamiento de la etapa a 37 grados Celsius.

Se requiere un soporte de placa de 35 milímetros justo antes de visualizar las celdas. Haga lo siguiente. Primero, reemplace cualquier medio celular que contenga rojo de fenol por uno sin rojo de fenol.

Comience a obtener imágenes de las células de inmediato. Los gránulos de estrés se formarán en menos de una hora, por lo que el estrés se inducirá después de la visualización de las células. Es importante iniciar las adquisiciones lo antes posible después de la inducción del estrés, y ajustar con precisión dos parámetros dependiendo de su tipo de célula y su tipo de proteína.

La intensidad del láser y la duración de las adquisiciones son menores que ambas para reducir la citotoxicidad. A continuación, vea las celdas con un objetivo de inmersión en aceite de 40 x y 63 x. Asegúrese de que la placa esté plana en el soporte y use la luz fluorescente mínimamente.

Una vez localizado un campo de interés, utilice el software para adquirir imágenes. Comience con la potencia del láser al 10% o menos, y ajuste la ganancia y el desplazamiento para obtener la mejor relación señal/ruido posible. Escanee a 1000 hercios para minimizar la exposición de las células al láser, configure la pila de enfermedades según lo deseado y mantenga el intervalo de escaneo el mayor tiempo posible para mantener mejor la salud del cultivo.

Adquiera datos durante el tiempo que sea necesario en MEF, los gránulos se forman en 10 minutos y son claramente visibles en una hora. En las neuronas, el proceso es un poco más lento. G tres BP debe proporcionar una señal razonablemente fuerte durante al menos 45 minutos utilizando las técnicas descritas.

Se monitoreó la formación de gránulos de estrés en células cultivadas. La localización de la proteína marcada con G tres BP fue difusa en los mitos cultivados con citoplasma, y también difusa en el citoplasma de las neuronas. Con el tratamiento con arsonita, las proteínas se localizan claramente en focos definidos y más grandes en cualquier tipo de célula.

Estos son los gránulos de estrés. Las imágenes tomadas se pueden reconstruir en una película de lapso de tiempo. El primer y segundo video muestran fibroblastos respondiendo al estrés.

El tercer video muestra lo mismo. En una neurona del hipocampo, las reconstrucciones de Zack ofrecen la localización en 3D de la G marcada tres B bp y, por lo tanto, una perspectiva diferente sobre el seguimiento. Siguiendo este procedimiento, se puede utilizar la inmunocitoquímica para visualizar los componentes de los gránulos después de diferentes tipos de estrés y después de la autofijación.

Esto puede responder preguntas cuantitativas sobre el tamaño y el número de los diferentes cuerpos celulares en diferentes condiciones.