Modellazione di Carcinoma renale metastatico spontanea (MRCC) in topi dopo nefrectomia

L'obiettivo generale di questa procedura è generare un carcinoma a cellule renali metastatico spontaneo clinicamente rilevante. Ciò si ottiene preparando prima le cellule reka Luke per l'impianto. Il secondo passo consiste nell'eseguire un impianto ortotopico di cellule tumorali renali.

Successivamente, dopo che il tumore è cresciuto, il tumore primario viene rimosso eseguendo una nefrectomia. Il passo finale consiste nel monitorare la progressione delle metastasi spontanee post-nefrectomia e valutare la distribuzione della malattia in varie sedi. In definitiva, questo protocollo consente il monitoraggio della malattia da carcinoma a cellule renali metastatico spontaneo e offre una linea guida per standardizzare la valutazione dell'efficacia delle terapie sperimentali.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come i metodi di impianto di cellule tumorali ectopiche, spesso superficiali o sottocutanee, è che ricapitola il carcinoma a cellule renali o RCC come si presenta nei pazienti, il che include la capacità delle cellule tumorali di diffondersi al resto del corpo. Le implicazioni di questa tecnica si estendono al trattamento del carcinoma a cellule renali perché è la malattia dismetastatica sistematica che è la causa primaria di mortalità nei pazienti. I modelli murini in genere non trattano la malattia metastatica spontanea che a volte può seguire la nefrectomia.

Tuttavia, questo metodo può fornire informazioni sulla malattia RCC metastatica spontanea. Può essere applicato anche ad altri tipi di cancro in cui la rimozione primaria del tumore è tipica e la principale causa di mortalità è la recidiva della malattia metastatica chirurgica. Ciò include modelli di seno e melanoma, tra gli altri.

Generalmente le persone nuove a questo metodo avranno difficoltà a causa in primo luogo, della difficoltà nel trovare il rene e garantire che le cellule tumorali rimangano localizzate dopo l'impianto e non perdano. E in secondo luogo, l'efficacia ne viene eseguita in modo efficiente e consente il recupero post-chirurgico. Prima dell'impianto ortotopico, coltivare le cellule reca marcate con luciferasi di topo o le cellule reka Luke come monostrato al 75% di fluenza co dopo tripsina, izzazione e sospensione di resus in centrifuga di terreni contenenti FBS al 5%, le cellule che si ripetono tre volte con un lavaggio in PBS, quindi riprospendono le cellule in terreni privi di siero a una concentrazione di cinque volte 10 al quarto renco Luke per cinque microlitri di terreni privi di siero.

Dopo aver anestetizzato un topo di mare intestinale con due o 3% di fluoro, pizzicare un piede per verificare la presenza di un'anestesia sufficiente dopo aver applicato un unguento veterinario sugli occhi per prevenire l'essiccazione, posizionare il topo in posizione sdraiata laterale destra e radere il lato sinistro tra i quattro e gli arti posteriori. Quindi applicare alcol e iodio lungo la zona lombare dorsale. Usa le forbici chirurgiche per praticare un'incisione cutanea di un centimetro in direzione longitudinale tra l'ultima costola e l'articolazione dell'anca.

Quindi utilizzare le forbici da dissezione smussate per allentare il tessuto connettivo sotto la pelle. Successivamente, utilizzare le forbici chirurgiche per praticare un'incisione di 0,5 centimetri in direzione longitudinale nella parete addominale. Ora usa una pinza curva per spingere delicatamente verso il basso intorno alla ferita aperta.

Questo esteriorizza il rene e consente una delicata immobilizzazione dell'organo prima dell'iniezione. Caricare una siringa di Hamilton con cinque microlitri della miscela cellulare preparata per un impianto subcapsulare superficiale. Tenere l'ago parallelo al rene orientato longitudinalmente con il bordo smussato verso l'alto e inserire l'ago sotto la capsula renale, ma sopra il parenchima.

Una volta posizionato l'ago, iniettare tutte le cellule fino a formare una piccola bolla bianca. Rimuovere lentamente l'ago dalla capsula e utilizzare immediatamente un applicatore sterile con punta di cotone per bloccare il sito di iniezione per un impianto sottocapsulare interno. A partire dal lato del rene opposto al sito di impianto desiderato.

Tenere l'ago con il bordo smussato verso l'alto e verso l'interno. Inserirlo attraverso l'interno del rene fino a quando l'ago è visibile, ma senza perforare lo spazio sottocapsulare sul lato opposto. Iniettare le cellule fino a formare una bolla bianca e tamponare il sito di iniezione per evitare perdite.

Rimetti delicatamente il rene nella cavità del corpo. Chiudere la parete addominale utilizzando la sutura riassorbibile 5.0 Vicryl. Una volta completato, tenere insieme lo strato cutaneo e posizionare due o tre clip per ferite prima del recupero.

Somministrare 500 microlitri di cloruro di sodio allo 0,9% e 100 microlitri di buprenorfina per via sottocutanea. Da 26 a 30 giorni dopo l'impianto, anestetizzare l'animale ed esporre il rene come prima. Quindi usa una pinza per rimuovere delicatamente il tessuto adiposo di collegamento dall'estremità del rene e rimuovere la ghiandola surrenale dall'estremità cranica.

Usa una pinza per afferrare delicatamente il rene e poi fai scorrere una sutura Vicryl 5.0 assorbibile attorno all'uretere, all'arteria renale e alla vena renale. Quindi, fare lentamente un doppio nodo dopo aver serrato i fili con gli emostatici. Usa le forbici per tagliare sopra il nodo e rimuovere il rene.

Una volta rimosso il rene, controllare attentamente la presenza di eventuali sanguinamenti dalla marea, dall'arteria e cauterizzare se necessario. Dopo aver suturato la parete addominale del corpo con Vicryl 5.0, utilizzare clip per ferite per chiudere la pelle. Monitora quotidianamente l'animale per segni di angoscia, sanguinamento o mobilità limitata.

Dopo l'eutanasia dell'animale, utilizzare le forbici chirurgiche per praticare un'incisione che inizia sopra l'uretra e continua lungo la cavità toracica fino alla mandibola inferiore. Usa le forbici smussate per separare la pelle dal muscolo della parete addominale. Quindi, taglia la pelle lungo le braccia e le gambe e stacca lentamente la pelle.

Esaminare attentamente la fascia cutanea e la parete addominale per verificare la presenza di noduli. Quindi esaminare i linfonodi superficiali. Praticare un'incisione nella parete addominale e tagliare lungo i lati sinistro e destro fino al diaframma.

Con un taglio orizzontale. Rimuovere la parte anteriore della parete addominale per esporre i visceri. Esaminare l'aspetto indisturbato dei visceri alla ricerca di tumori grossolanamente notevoli.

Annotare anche il contenuto dello stomaco e dell'intestino per prove di cibo o emorragie. Valutando visivamente ogni organo per la presenza o l'assenza del tumore Lavorando su una lista di controllo di 22 siti, i punteggi vengono tabulati per gli animali in un particolare gruppo per confrontare la distribuzione della malattia. Ora rimuovi con cura il fegato e lavalo con PBS.

Quindi esaminalo per tumori o anomalie grossolane e valutalo come prima. Quindi procedi alla rimozione e all'incisione della milza, del rene e del pancreas. Successivamente, ispezionare i linfonodi addominali, compresi i linfonodi lombari sacrali, renali e mesenterici.

Dopo aver valutato il diaframma per l'evidenza di diffusione metastatica, rimuovere il diaframma e praticare due incisioni laterali nella cavità toracica, rimuovendo la parte frontale per esporre i polmoni e il cuore, sollevare delicatamente l'esofago e tagliare la trachea sopra il cuore. Dopo aver rimosso i polmoni e il cuore, valutare i tessuti per i noduli. Quindi, usa il forcipe per stringere il cuore.

Una mancanza di consistenza molleggiante può indicare la presenza di un tumore. Infine, usa le forbici chirurgiche per tagliare linearmente il cranio. Rimuovi delicatamente piccoli pezzi di cranio fino a quando l'intero cervello non è esposto.

Un sistema di punteggio visivo è stato utilizzato per valutare la malattia, la distribuzione e la gravità della malattia in cinque diversi gruppi di animali. Questi gruppi hanno mostrato una diversa estensione e gravità della malattia. Un'ulteriore misurazione consistente nell'imaging bioluminescente immediatamente dopo il sacrificio è stata utilizzata per valutare quantitativamente le lesioni micro e macro metastatiche.

Una volta padroneggiati entrambi gli impianti, la nefrectomia o la necroscopia possono essere eseguiti in 5-10 minuti per animale, se eseguiti correttamente. Esaminare se le risposte al trattamento differirebbero tra i tipi di cellule tumorali metastatiche. Cellule di carcinoma a cellule renali metastatico.

I pazienti vengono attualmente utilizzati per l'impianto diretto negli animali per valutare la crescita locale e metastatica della malattia dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'RCC per esplorare la progressione della malattia e le risposte alla terapia clinicamente rilevanti. In particolare, se tali risposte differiscono a seconda della malattia localizzata primaria o della crescita metastatica spontanea.

Non dimenticare che lavorare con piccoli animali che si sottopongono a più interventi chirurgici richiede una stretta aderenza alle linee guida del protocollo animale istituzionale e condizioni sterili. Il comfort e il recupero degli animali sono variabili critiche da eseguire correttamente con questa procedura.