Imageamento ao vivo para estudar a instabilidade dinâmica dos microtúbulos em cânceres de mama resistentes a taxanos

O objetivo geral deste experimento é medir a instabilidade dinâmica dos microtúbulos em células de câncer de mama resistentes ao docetaxel. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia celular sobre a instabilidade dinâmica dos microtúbulos em condições fisiológicas e após vários tratamentos medicamentosos. As principais vantagens desta técnica são que ela fornece um protocolo simples, confiável e fisiologicamente aplicável para estudar a dinâmica dos microtúbulos em células vivas.

Antes de iniciar o procedimento, cultive as células do câncer de mama em meio de cultura completo em placas de cultura de 10 centímetros a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até o grau apropriado de confluência. No dia anterior ao experimento, enxágue as lamínulas de vidro revestidas de poli L-lisina de 24 milímetros com álcool a 70% e exponha as lamelas à luz ultravioleta durante a noite. Na manhã seguinte, coloque uma lamínula em cada poço de uma placa de seis poços.

Em seguida, lave as culturas com PBS e retire as células de cada placa com 0,5 mililitros de tripsina EDTA. Quando as células começarem a se levantar do fundo da placa, neutralize a tripsina com cinco mililitros de meio de cultura fresco e conte as células. Em seguida, adicione aproximadamente uma vez 10 as quintas células a cada lamínula, agite a placa suavemente e retorne as células à incubadora por pelo menos 36 horas.

Para testar a dinâmica dos microtúbulos das células, misture a solução estoque de tubulina alfa marcada com GFP várias vezes por inversão para garantir uma solução homogênea sem vórtice. Em seguida, substitua o meio de cultura em cada poço por dois mililitros de meio fresco contendo 40 microlitros da tubulina etiquetada. Agitar suavemente a placa para permitir a mistura completa do marcador com o meio de cultura e voltar a colocar a placa na incubadora durante mais 24 horas.

No dia seguinte, substitua o meio de cultura por meio fresco contendo docetaxel e retorne a placa à incubadora por 30 minutos. Enquanto as células estão sendo inibidas, ligue o microscópio de fluorescência invertida e pré-aqueça o suporte da amostra a 37 graus Celsius. Em seguida, selecione a lente objetiva de óleo 60X 1.42 NA e monte a primeira lamínula no suporte de amostra.

Cubra a amostra com um mililitro de docetaxel fresco a 37 graus Celsius contendo meio e localize um aglomerado de células planas exibindo uma alta intensidade de fluorescência de tubulina alfa marcada com GFP com estruturas de microtúbulos claramente visíveis. Concentre-se na área periférica de uma das células do aglomerado e defina o tempo de exposição apropriado na frequência de aquisição da imagem. Exatamente 50 minutos após a adição da primeira alíquota de docetaxel, comece a registrar a dinâmica dos microtúbulos por dois minutos, obtendo uma foto a cada dois segundos.

Quando todas as imagens tiverem sido adquiridas, crie imagens da próxima célula como acabamos de demonstrar, até que as imagens de cinco células no total de todos os três poços de cada concentração de docetaxel tenham sido capturadas. Quando todas as imagens tiverem sido adquiridas para cada concentração de inibidor, abra o programa de deconvolução, dentro do sistema de microscópio e clique no processo. Em seguida, selecione deconvolver e arraste o arquivo de imagem para a janela de entrada.

Clique em fazer para desconvolver a imagem e abra o arquivo de imagem deconvolvida no software do microscópio. Clique em arquivo e salve como filme. Defina o formato do filme como AV e o estilo de animação como para frente.

Defina a qualidade da compactação para 100%e a taxa de quadros para cinco por segundo. Em seguida, marque a caixa animar ao longo do tempo e clique em fazer para gerar o vídeo. Neste experimento representativo, células de câncer de mama normais e resistentes ao docetaxel foram tratadas com docetaxel e fotografadas como acabamos de demonstrar, mas os efeitos do tratamento no crescimento e encurtamento dos microtúbulos, mais evidentes nas células não resistentes ao docetaxel.

De fato, medir a taxa de crescimento e encurtamento dos microtúbulos sob condições de tratamento com docetaxel de 0,5 micromolar revela uma forte inibição da dinâmica da tubulina das células parentais, mas não resistentes ao docetaxel. Uma vez dominado, todo o processo pode ser concluído em 60 horas se as técnicas forem executadas corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de selecionar células planas, com alta intensidade de fluorescência da tubulina GFP, e reduzir a intensidade da fluorescência de excitação e a duração da exposição para evitar o desbotamento da fluorescência GFP.

Desde o seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores nas áreas de biologia celular e do câncer avaliarem os efeitos de vários agentes direcionados a microtúbulos em células normais e cancerígenas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir a instabilidade dinâmica dos microtúbulos em células vivas sob uma variedade de condições.