Name: Imageamento ao vivo para estudar a instabilidade dinâmica dos microtúbulos em cânceres de mama resistentes a taxanos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Aprenda a medir a instabilidade dinâmica dos microtúbulos em células de câncer de mama resistentes a docetaxel usando microscopia de deconvolução e GFP-tubulina. Este método permite visualizar em tempo real o comportamento dos microtúbulos sob tratamento com fármacos.

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Esta pesquisa é apoiada por financiamento do CBCF (para ZW).

1. Preparar as células for Imaging ao vivo <ol><li> Cultura de células e sementeira <ol><li> Utilização de células MCF-7 de cancro da mama seleccionados para resistência ao docetaxel (MCF-7 TXT) e sua linha celular parental não resistente (MCF-7 CC). O processo de selecção detalhada e a caracterização destas linhas celulares seleccionadas foram descritos anteriormente 24. </li><li> Cresça todas as células em placas de cultura de 10 cm a 37 ° C num meio composto de 90% de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e 10% de soro fetal de bovino (FBS) e suplementado com aminoácidos não-essenciais. Manter o meio numa atmosfera de 5% de CO 2. Manter as células MCF-7 em TXT 5 nM de docetaxel. </li><li> Semear as células em lamelas para geração de imagens ao vivo. Esterilizar 24 mm lamelas de vidro com poli-L-lisina-revestidas, enxaguando-as com álcool a 70% e, em seguida, expondo-os a radiação UV durante a noite. Coloque as lamelas numa placa de cultura de 6 poços de 35 mm. Place uma lamela em cada poço. </li><li> Remover o meio a partir da placa de cultura de 10 cm e lavar as células com PBS. Adicionar 0,5 ml de tripsina-EDTA para o prato para separar as células do prato. Adicionar 5 ml de meio de cultura para o prato para neutralizar a tripsina seguindo o descolamento das células. </li><li> Contar as células com um hemocitómetro para determinar o número de células por unidade de volume. </li><li> Adicionar cerca de 5 a 10 células em cada poço com base no número de células por unidade de volume. Depois de sacudi-la gentilmente, pôs o prato de volta para a incubadora para permitir que as células para anexar as lamelas. </li></ol></li><li> Expressão de GFP α-tubulina <ol><li> Para ensaiar dinâmica dos microtúbulos, transduzir as células com GFP α-tubulina com controlo a transdução de GFP comercial (por exemplo, BacMam) de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Cultura das células nos poços durante 36 h numa incubadora de cultura de células de 37 ° C para permitir COMpleta adesão e 60% de confluência. </li><li> Calcular o volume apropriado de GFP α-tubulina para adicionar a cada poço, de acordo com a seguinte equação: <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/55027/55027eq1.jpg" /> O número de células é o número estimado de células no poço no momento da marcação e o PPC desejado é o número de partículas por célula. NOTA: Semear as células MCF-7 deveria ter o dobro da contagem de células a partir de 10 5 a 2 x 10 5 com um PPC desejada de 20, o volume necessário para cada lamela é, por conseguinte, 40 ul. Para diferentes células, o volume calculado com base na fórmula acima pode ser o melhor. O volume exato deve ser ajustada de acordo com o nível de expressão real da GFP-tubulina. </li><li> Misture a a-tubulina várias vezes GFP por inversão para assegurar uma solução homogénea. não vortex. NOTA: Para o controle, o (controle) reagente nulo carece de qualquer genética de mamíferoselementos e pode ser usado para ajudar a determinar os potenciais efeitos mediada por baculovírus e fluorescência de fundo. Um controle de transdução não-alvo GFP podem também ser utilizados, o que irá acender-se toda a célula. </li><li> Substituir o meio de cultura com meio fresco. Adicionar 2 ml do novo meio e 40 uL de GFP α-tubulina a cada poço. </li><li> Agitar a placa suavemente para permitir uma mistura completa de GFP α-tubulina com o meio de cultura. Retornar a placa na incubadora e incubar a cultura durante 24 horas para permitir a expressão de GFP-tubulina. </li></ol></li><li> Células Tratar com docetaxel NOTA: Esta experiência é testar o efeito do docetaxel na instabilidade dinâmica dos microtúbulos. Assim, as células são tratadas com a concentração desejada de docetaxel. <ol><li> Prepara-se uma forma composta de 90% de DMEM e 10% de FBS e suplementado com aminoácidos não-essenciais. Use DMEM sem vermelho de fenol vermelho de fenol porque pode interferir com o fluorescence de GFP-tubulina. Adicionar a concentração desejada de docetaxel (variando de 10 nM a 10 uM). A solução estoque de docetaxel é 10 mM em sulfóxido de dimetilo (DMSO). </li><li> Pré-aquecer o meio contendo docetaxel a 37 ° C na incubadora de cultura de tecidos. </li><li> Substituir o meio normal de cultura com o meio contendo docetaxel e incubar durante 30 min no incubador de cultura de tecido. Deve haver pelo menos 3 lamelas por poço para cada concentração de docetaxel. </li></ol></li></ol> 2. Imagens ao vivo para examinar microtúbulos instabilidade dinâmica <ol><li> Configurando o sistema <ol><li> Realizar experiências numa câmara mantida a 37 ° C e 5% de CO 2. Adquirir imagens de fluorescência por lapso de tempo com um sistema microscópico equipado com um 60X, lente objetiva 1,42 NA óleo em um microscópio de fluorescência invertido e com uma câmera CCD. </li><li> Configurar as células para geração de imagens ao vivo. tanto o titular pré-aquecer a amostra eo meio para 37 ° C. Escolha uma lamela para examinar. Colocar a tampa de interesse num suporte de amostra e incuba-se com 1 ml de meio contendo docetaxel preparado no passo 1.3.1. </li></ol></li><li> Imagens ao vivo de microtúbulos instabilidade dinâmica <ol><li> Identificar as células que serão utilizadas para imagiologia. Eles devem ser plana, tem uma elevada intensidade de fluorescência de GFP expressa-tubulina, e tem estruturas de microtúbulos claras. </li><li> Escolha uma célula do grupo de células identificadas a partir da etapa 2.2.1 examinar em primeiro lugar. Concentre-se na área periférica da célula identificada. Configurar o programa para o tempo de exposição e a frequência de aquisição de imagem. Como o tempo de exposição é geralmente 0,5 s, as imagens serão adquiridas a cada dois s. </li><li> Permitir que um 20 min adicional para os passos de 1,33 para 2.2.3. Assim, exactamente 50 min após a adição de docetaxel, tal como descrito no passo 1.3.3, iniciar imagem (isto é para a normalização). </li><li> Grave a microtúbulos dynamics por 2 min, tirar uma foto a cada 2 s. No total, 60 adquirir imagens para a célula identificado. </li><li> Mover para a próxima célula identificada e repita os passos 2.2.2 a 2.2.4. Repita o procedimento até 5 células foram fotografadas. É imperativo que fazer isso antes do tempo atinge 70 min após a adição de docetaxel, tal como descrito no passo 1.3.3. </li><li> Para cada condição de tratamento, repita os passos 2.2.1 a 2.2.5 para 3 lamelas diferentes. No total, as células de imagem 15, que há dados suficientes para medir microtúbulos instabilidade dinâmica. </li></ol></li></ol> 3. Processamento de Imagem e Análise de Dados <ol><li> Deconvolution de imagens <ol><li> Deconvoluir as imagens adquiridas para alcançar uma alta qualidade. Abra o programa de desconvolução equipado com o sistema de microscópio. </li><li> Clique em &quot;Processos&quot; e selecione &quot;deconvoluir.&quot; Arraste o arquivo de imagem para a janela &quot;Input&quot; e clique em &quot;Do.&quot; O arquivo de imagem será deconvolved, eoarquivo deconvolved será salvo como um novo arquivo automaticamente. </li></ol></li><li> Geração de vídeos <ol><li> Clique no arquivo de imagem deconvolved de abrir com software equipado. </li><li> Clique em &quot;Arquivo&quot; e selecione &quot;Salvar como filme.&quot; Selecione a opção &quot;formato de Filme&quot; como &quot;AV&quot; e o &quot;estilo de Animação&quot;, como &quot;Forward&quot;. Defina a &quot;qualidade de compressão&quot; para &quot;100%&quot; e &quot;Taxa de quadros&quot; para &quot;5 / segundo.&quot; </li><li> Marque a caixa de &quot;Animar através do tempo&quot; e clique em &quot;Faça isso.&quot; O vídeo será gerado. </li></ol></li><li> Medição de encurtamento dos microtúbulos ea taxa de crescimento <ol><li> Identificar os microtúbulos que serão usados ​​para a medição. Para cada célula, a poucos microtúbulos será capaz de ter o seu encurtamento ou crescimento seguido clara e completamente. </li><li> Analisar cada quadro de vídeo para identificar o quadro que mostra o comprimento de partida da um microtúbulond do quadro com a microtúbulos mais prorrogado ou reduzido. Medir a variação de comprimento entre as duas microtúbulos e o tempo decorrido entre as duas armações. </li><li> Calcula-se a taxa de crescimento ou encurtamento dividindo a mudança no comprimento de tempo (a unidade é um / s). Para cada condição de tratamento, siga pelo menos 10 células e medir pelo menos 20 microtúbulos. </li><li> Calcule a média eo desvio-padrão para cada condição de tratamento. Analisar a diferença estatística entre as condições utilizando o teste de Student. Reportam os dados em uma tabela e / ou em um gráfico. </li></ol></li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Existem dois métodos principais para medir instabilidade dinâmica dos microtúbulos: in vitro e in vivo. No método in vitro, tubulina purificada é usada para medir a instabilidade dinâmica dos microtúbulos com microscopia de contraste de interferência diferencial-lapso de tempo melhorado-computador. No método in vivo, microinjectados tubulina fluorescente, ou expressaram a GFP-tubulina, é incorporado em microtúbulos. A dinâmica (crescimento e encurtamento) dos microtúbulos é então grav...

<html> A principal causa de mortalidade por câncer de mama é através de metástases 1, 2. Os taxanos, como o docetaxel e o paclitaxel, são actualmente utilizados como esquemas de primeira linha para o tratamento de cancro da mama metastático 2, 3, 4, 5, 6. Eles fazem parte de um grupo de agentes de metas de microtúbulos (MTA) que interrompem a dinâmica dos microtúbulos. No entanto, um dos maiores desafios para a utilização em terapia curativa taxanos é o desenvolvimento de resistência taxano em células de cancro, o que leva à recorrência da doença sete. A resistência às drogas é responsável por mais de 90% de todas as mortes entre os pacientes com câncer de mama metastático 7. Os microtúbulos são formados pela polimerização de heterodímeros a- e p-tubulinaclass = &quot;xref&quot;&gt; 8, 9. A regulação exacta da dinâmica dos microtúbulos é importante para muitas funções celulares, incluindo a célula de polarização, progressão do ciclo celular, o transporte intracelular e a sinalização celular. Desregulação dos microtúbulos e sua dinâmica irá interromper a função das células e resultar em morte celular 10, 11. Dependendo de como eles causam esta desregulação, drogas MTA pode ser classificada quer como agentes de estabilização de microtúbulos (isto é, taxanos) ou agentes de microtúbulos-destabalizing (isto é, alcalóides vinca, colchicina ou local agentes de ligação) 20. Apesar dos seus efeitos opostos sobre a massa de microtúbulos, numa dosagem suficiente, ambas as classes podem matar as células cancerosas através dos seus efeitos sobre a dinâmica dos microtúbulos 21. Os taxanos funcionar primariamente por estabilização de microtúbulos do fuso 12, levando adesalinhamento cromossómico. A subsequente activação perpétua do checkpoint de montagem do fuso (SAC) prende a célula na mitose. Paragem da mitose prolongado, em seguida, faz com que a apoptose 13, 14. Taxano interage com os microtúbulos através do sítio de ligação taxano em β-tubulina 8, 15, que só está presente no tubulina montados 16. Vários mecanismos de resistência de taxano têm sido propostos 9, 17. Estes mecanismos incluem tanto a resistência a múltiplas drogas em geral, devido à sobre-expressão de proteínas e de resistência 5, 9, 18, 19 específicos de taxano de droga-efluxo. Por exemplo, as células cancerosas resistentes a taxano podem ter alterado a expressão e função de certos β-banheiraUlin isotipos 5, 9, 19, 20, 21, 22, 23. Ao usar um método in vivo para medir a instabilidade dinâmica dos microtúbulos, mostra-se que, quando comparado com a não-resistentes, parentais células MCF-7 CC 17, a dinâmica dos microtúbulos de células MCF-7 resistente ao TXT docetaxel são insensíveis ao tratamento com docetaxel. Para entender melhor a função de MTAs e o mecanismo exacto de taxano-resistência em células cancerosas, que é essencial para medir a dinâmica dos microtúbulos. Aqui, nós relatamos um método in vivo de fazê-lo. Utilizando imagens ao vivo em associação com a expressão de tubulina GFP em células, pode-se medir a dinâmica dos microtúbulos de células MCF-7 TXT e células MCF-7 com CC e without tratamento com docetaxel. Os resultados podem nos ajudar a projetar drogas mais eficazes que podem superar a resistência taxano.

<table><tbody><tr><td>Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco, Invitrogen</td><td>12483</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Anti (100x)</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>docetaxel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>01885-5mg-F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM fenol vermelho-livre</td><td>Gibco, Invitrogen</td><td>21063</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de CellLight *BacMam 2.0* GFP-tubulin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10613</td><td>Reagente chave para expressar tubulina de GFP em células</td></tr><tr><td>Reagente de CellLight *BacMam 2.0* GFP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B10383</td><td>Controle</td></tr><tr><td>Dimetil Sulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich+B9:AA9</td><td>472301</td><td>para dissolver decetaxel</td></tr><tr><td>22-mm coveslip de vidro</td><td>Fisher Scientifics</td><td>12-545-101</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de 6 poços</td><td>Greiner Bio-One International</td> Placa <td></td>de <td>cultura Celi de 6 poços</td></tr><tr><td>DeltaVision Microscopy Imaging Systems</td><td>GE Health</td><td></td><td>Este sistema está equipado com estação meteorológica para controle de temperatura e CO2. Também é equipado com o software Worx para controle de deconvolução e lapso de tempo.</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>conjunto de hemactómetros de linha brilhante, Hausser Scientific</td><td>Hausser Scientific, distribuído pela VWR</td><td>N.º do fornecedor: 1492 N.º da VWR:15170-172</td><td></td></tr></tbody></table>

imagens ao vivo para estudar microtúbulos instabilidade dinâmica em cancros da mama resistentes a taxano

Live Imaging to Study Microtubule Dynamic Instability in Taxane-resistant Breast Cancers

Taxanos como o docetaxel pertencem a um grupo de agentes direcionados aos microtúbulos (MTAs) que são comumente usados para tratar o câncer. No entanto, a resistência ao taxano em células cancerígenas reduz drasticamente a eficácia do uso a longo prazo dos medicamentos. Evidências acumuladas sugerem que os mecanismos subjacentes à resistência ao taxano incluem mecanismos gerais, como o desenvolvimento de resistência a múltiplas drogas devido à superexpressão de proteínas de efluxo de drogas, e mecanismos específicos de taxano, como aqueles que envolvem a dinâmica dos microtúbulos. 
Como os taxanos têm como alvo os microtúbulos celulares, medir a instabilidade dinâmica dos microtúbulos é uma etapa importante na determinação dos mecanismos de resistência ao taxano e fornece informações sobre como superar essa resistência. No experimento, um método in vivo foi usado para medir a instabilidade dinâmica dos microtúbulos. A α-tubulina marcada com GFP foi expressa e incorporada em microtúbulos em células MCF-7, permitindo o registro da dinâmica dos microtúbulos por lapso de tempo usando uma câmera sensível. Os resultados mostraram que, ao contrário das célulasMCF-7 CC parentais não resistentes, a dinâmica dos microtúbulos das célulasMCF-7 TXT resistentes ao docetaxel é insensível ao tratamento com docetaxel, o que causa a resistência à parada mitótica e apoptose induzida pelo docetaxel. Este artigo descreverá este método in vivo de medir a instabilidade dinâmica dos microtúbulos.

Usando o protocolo aqui apresentado, foram estudados os efeitos do docetaxel sobre a dinâmica dos microtúbulos de (MCF-7) TXT células cancerosas de mama normal (MCF-7 CC) e docetaxel-resistente. Dois conjuntos de imagens mostram os efeitos do docetaxel (0,5 ^ M) sobre o crescimento e encurtamento dos microtúbulos em células MCF-7 CC e MCF-7 TXT células (Figura 1A). T...

Neste artigo, relatamos um protocolo que descreve um método in vivo para medir a instabilidade dinâmica dos microtúbulos em células de câncer de mama resistentes ao docetaxel (MCF-7TXT). Neste método, um sistema de imagem de microscopia de deconvolução é usado para detectar a expressão de GFP-tubulina em células-alvo.

Imagens ao vivo para estudar microtúbulos instabilidade dinâmica em cancros da mama resistentes a taxano

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane ...

O objetivo geral deste experimento é medir a instabilidade dinâmica dos microtúbulos em células de câncer de mama resistentes ao docetaxel. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia celular sobre a instabilidade dinâmica dos microtúbulos em condições fisiológicas e após vários tratamentos medicamentosos. As principais vantagens desta técnica são que ela fornece um protocolo simples, confiável e fisiologicamente aplicável para estudar a dinâmica dos microtúbulos em células vivas.Antes de iniciar o procedimento, cultive as células do câncer de mama em meio de cultura completo em placas de cultura de 10 centímetros a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até o grau apropriado de confluência. No dia anterior ao experimento, enxágue as lamínulas de vidro revestidas de poli L-lisina de 24 milímetros com álcool a 70% e exponha as lamelas à luz ultravioleta durante a noite. Na manhã seguinte, coloque uma lamínula em cada poço de uma placa de seis poços.Em seguida, lave as culturas com PBS e retire as células de cada placa com 0,5 mililitros de tripsina EDTA. Quando as células começarem a se levantar do fundo da placa, neutralize a tripsina com cinco mi

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Um modelo de camundongo experimental de metástase óssea foi estabelecido após a entrega intracardíaca da luciferase expressando células tumorais mamárias. Desenvolvimento do tumor e resultou lesão osteolítica foram monitorados longitudinalmente, com a bioluminescência e CT micro imagem.

Monitoramento metástases tumorais e lesões osteolíticas com bioluminescência e CT Micro Imagem

Descreve-se um método para a resposta de imagem para tratamento...

Viver de imagem de Respostas de drogas no microambiente tumoral em modelos do rato do cancro da mama

Lapso de tempo de imagem é utilizado para avaliar o comportamento dos principais pré-neoplásicas células epiteliais mamárias derivados de modelos de ratos geneticamente modificados de risco de câncer de mama para determinar se há correlação entre os parâmetros específicos de comportamento e distintas lesões genéticas.

Lapso de tempo de imagem de pré-neoplásicas primárias células epiteliais mamárias derivados de modelos de rato geneticamente modificado do cancro da mama

Usando camundongos repórteres transgênicos e marcadores fluorescentes injetáveis, a microscopia confocal de disco giratório intravital de longo prazo permite a visualização direta do comportamento das células mielóides no adenoma intestinal no modelo de câncer colorretal ApcMin / +.

Imagens em tempo real de células mielóides em Dynamics Apc Min / + Intestinal Tumores girando Disk microscopia confocal

Aqui, descrevemos um método de microscopia de lapso de tempo de longo prazo para rastrear longitudinalmente células individuais em resposta à terapêutica anticâncer.

Through the Looking Glass: Microscopia Time-lapse e Longitudinal de rastreamento de células individuais para estudar Therapeutics Anti-câncer

Este protocolo descreve o uso de microscopia multifotônica para executar imagiologia prolongado de lapso de tempo de interacções multicelulares em tempo real, in vivo, a resolução de células simples.

Estendida Time-lapse Imagem intravital do Real-time multicelular Dynamics no microambiente tumoral

Aqui, apresentamos o monitoramento em tempo real de migração celular em um ensaio de cicatrização de feridas utilizando empobrecido TIP60 MCF10A mama células epiteliais. A implementação de técnicas de imagem de viver-pilha em nosso protocolo nos permite analisar e visualizar o movimento de célula única em tempo real e ao longo do tempo.

Imagens ao vivo de migração de células epiteliais da mama após o esgotamento de transiente de TIP60

Imagem latente da viver-pilha fornece uma riqueza de informações sobre células únicas ou populações inteiras que é inatingível por célula fixa imagem sozinho. Aqui, viver-pilha protocolos de imagens para avaliar as decisões de destino célula após o tratamento com a droga antimitótica paclitaxel são descritos.

A longo prazo viver-pilha de imagem para avaliar o destino da célula em resposta ao Paclitaxel

Foi apresentado um protocolo para a imagem dos microtúbulos dinâmicos in vivo usando proteína de ligação final rotulada fluorescente. Descrevemos os métodos para rotular, imagem e analisar os microtúbulos dinâmicos no neurônio de microtúbulo lateral posterior (PLM) de C. elegans.

In vivo Avaliação da Dinâmica e Orientação em Caenorhabditis elegans Neurônios

Aqui, um ensaio de reconstituição in vitro baseado em microscopia TIRF é apresentado para quantificar e comparar simultaneamente a dinâmica de duas populações de microtúbulos. Um método é descrito para visualizar simultaneamente a atividade coletiva de múltiplas proteínas associadas a microtúbulos em feixes de microtúbulos interligados e microtúbulos únicos.

Visualização Simultânea da Dinâmica dos Microtúbulos Cruzados e Únicos In Vitro pela Microscopia TIRF

Relatamos uma técnica que permite imagens ao vivo da dinâmica dos microtúbulos em células de glioblastoma (GBM) invadindo um tecido cerebral de vertebrados. O acoplamento da injeção ortotópica de células GBM marcadas fluorescentemente em um cérebro transparente de peixe-zebra com imagens intravitais de alta resolução permite a medição da dinâmica do citoesqueleto durante a invasão do câncer in situ .

Imagem ao vivo da dinâmica dos microtúbulos em células de glioblastoma invadindo o cérebro do peixe-zebra

Aprenda a medir a instabilidade dinâmica dos microtúbulos em células de câncer de mama resistentes a docetaxel usando microscopia de deconvolução e GFP-tubulina. Este método permite visualizar em tempo real o comportamento dos microtúbulos sob tratamento com fármacos.

Imagens ao vivo para estudar microtúbulos instabilidade dinâmica em cancros da mama resistentes a taxano

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