Fabrication d'électrodes ampérométriques
Summary
Ce protocole décrit comment générer des électrodes en fibre de carbone. Les électrodes sont ensuite utilisés pour détecter la libération de catécholamines à partir des vésicules avec ampérométrie en fibre de carbone.
Abstract
Électrodes en fibre de carbone sont cruciaux pour la détection de la libération de catécholamines à partir de vésicules dans des cellules individuelles pour des mesures ampérométrie. Ici, nous décrivons les techniques nécessaires pour produire un bruit faible (<0,5 Pa) électrodes. Les techniques ont été modifiés à partir des descriptions publiées par les chercheurs précédents (1,2). Les électrodes sont faites par la préparation de fibres de carbone et de les enfiler individuellement dans chaque tube capillaire en utilisant un aspirateur avec un filtre pour aspirer la fibre. Ensuite, le tube capillaire avec la fibre est tirée par un extracteur d'électrode, la création de deux moitiés, chacune avec une pointe à pointe fine. Les électrodes sont plongées dans chaude, époxy liquide mélangée avec le durcisseur pour créer un joint verre-époxy. Enfin, les électrodes sont placées dans un four pour durcir l'époxy. Une manipulation soigneuse des électrodes est essentielle afin de s'assurer qu'elles sont faites de manière cohérente et sans dommage. Ce protocole montre comment fabriquer des électrodes ampérométriques et coupé pour l'enregistrement à partir des cellules individuelles.
Protocol
Discussion
Ce protocole décrit comment générer et couper des électrodes ampérométriques. Pendant les enregistrements ampérométrique, une électrode en fibre de carbone est placée contre la surface d'une cellule sécrétrice. L'activité est observée comme exocytotique pics ampérométriques, qui indique le courant électrochimique provoquée par le transfert d'électrons après oxydation des catécholamines. Avec la pratique et la découpe des électrodes ampérométriques, les niveaux de bruit peut être gra…
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Aaron P. Fox à l'Université de Chicago, dans le laboratoire duquel ce protocole a été conçu à l'origine, et William Roden (Université de Saint Louis) pour le développement ultérieur du protocole.
Nous remercions la Fondation Whitehall et la National Science Foundation pour le soutien.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Epoxy Hardener 1,3-phenylene-diamene flakes | Reagent | Sigma Aldrich | P23954-100G04 716AJ | Aliquots are stored in a dessicator and should not be exposed to light. |
| Carbon Fibers | Material | Goodfellow | C005725 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Material | Fisher | NC9836768 | |
| Epoxy Resin | Reagent | Miller-Stephenson | Epon Resin 828 | |
| Dissecting Microscope | Instrument | |||
| Electrode Puller | Instrument | Narishige Japan | PP-830 | 1st pull = 24.8 degrees C; 2nd pull = 62.7 degrees C |
| Oven | Instrument | set to 100 degrees F. | ||
| Hot plate | Instrument | set to 55 degrees C |
References
- Mundorf, M. L., Wightman, R. M. Amperometry and cyclic voltammetry with carbon fiber microelectrodes at single cells. Curr Protocols in Neurosci. 6 (14), 1-6 (2002).
- Machado, D. J., Montesinos, M. S., Borges, R. Good practices in single-cell amperometry. Methods in Molec. Biol. 440, 297-313 (2008).
