自制的网站定向诱变整个质粒
Summary
网站定向诱变整个质粒是一种简单的方法来创建原始质粒略有不同的变化。在这里，我们展示了一个简单而成本效益的方法，引入碱基质粒使用的标准试剂。
Abstract
网站定向诱变整个质粒是一种简单的方法来创建原始质粒略有不同的变化。使用这种方法克隆的目标的基因可以被改变替换，删除或插入直接插入质粒几个基地。它的工作原理简单地放大整个质粒在非基于PCR的热循环反应，。在反应过程中所需的突变，诱变引物，携带集成到新合成的质粒。在这个视频教程中，我们展示了一个简单而成本效益的方法，引入质粒碱基。该协议的工作原理与标准试剂，是独立于商业试剂盒，这往往是非常昂贵的。应用此协议可以降低总成本反应到什么成本，使用一些商业试剂盒第八。在这段视频中，我们还评论的关键步骤，在此过程中，给如何设计的诱变引物的详细说明。
Protocol
方法原理： 现场指挥整个质粒的突变解释这个视频是一个突变的方法，可以让您改变由直接到质粒的克隆目标基因替换，删除或插入几个基地。它的工作原理，放大整个质粒，在非基于PCR的热循环反应。在反应过程中，致突变的引物，携带所需的突变原质粒，在不匹配的形式集成到新合成的质粒。拆除原质粒从反应后的突变质粒得到转化E.大肠杆菌下面的步骤是筛选目?…
Discussion
网站定向诱变的方法，该方法提供了一种快速变异基因质粒进行了一个突变。只有一天可以完成整个反应。使用这种方法，将只需要一对携带所需的突变免费引物和一个校对，如PFU聚合酶聚合酶。新合成的质粒可以脱离父母的质粒，通过消化反应与限制性内切酶DpnI。这种酶消化甲基化的DNA。因此，只有新合成的质粒可转化。在本教程中，我们展示了表演一个网站定向诱变，通过使用自制的诱变套…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Pfu polymerase (recombinant or native) | fermentas | EP0571 or EP0501 | ||
| dNTP mix 10 mM | fermentas | R0191 | ||
| DpnI or DpnI Fast digest | fermentas | ER1701 | ||
| primers | invitrogen | desalted |
References
- Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. QuikChange site-directed mutagenesis. Strategies. 9, 3-4 (1996).
Cite This Article
Laible, M., Boonrod, K. Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids. J. Vis. Exp. (27), e1135, doi:10.3791/1135 (2009).