Homemade plaatsgerichte mutagenese van Whole Plasmids
Summary
Plaatsgerichte mutagenese van hele plasmiden is een eenvoudige manier om iets verschillende varianten van een origineel plasmide te creëren. Hier laten we zien op een eenvoudige en kosteneffectieve manier om de base substituties te introduceren in een plasmide met behulp van standaard reagentia.
Abstract
Plaatsgerichte mutagenese van hele plasmiden is een eenvoudige manier om iets verschillende varianten van een origineel plasmide te creëren. Met deze methode wordt de gekloonde doelwitgen kan worden gewijzigd door substitutie, deletie of insertie van een paar bases direct in een plasmide. Het werkt door simpelweg het versterken van de hele plasmide, in een niet PCR-gebaseerde thermocycling reactie. Tijdens de reactie mutagene primers, het dragen van de gewenste mutatie, zijn geïntegreerd in de nieuw gesynthetiseerde plasmide. In deze video tutorial tonen we aan een eenvoudige en kosteneffectieve manier om de base substituties introduceren in een plasmide. Het protocol werkt met standaard reagentia en is onafhankelijk van commerciële kits, die vaak erg duur. Toepassing van dit protocol kan de totale kosten van een reactie op een achtste van wat het kost met behulp van enkele van de commerciële kits. In deze video hebben we ook commentaar geven op kritische stappen tijdens het proces en geeft gedetailleerde instructies over hoe de mutagene primers te ontwerpen.
Protocol
Discussion
Plaatsgerichte mutagenese is een mutagenese-methode die een snelle manier om een gen gedragen door een plasmide muteren biedt. De hele reactie kan worden gedaan in slechts een dag. Met deze methode, zal het nodig hebben alleen maar een paar gratis primers het dragen van de gewenste mutaties en een proeflezen polymerase zoals Pfu-Polymerase. De nieuw gesynthetiseerde plasmide kan worden gescheiden van het ouderlijk plasmide door verteren de reactie met het restrictie-enzym DpnI. Dit enzym verteert alleen de gemethy…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Pfu polymerase (recombinant or native) | fermentas | EP0571 or EP0501 | ||
| dNTP mix 10 mM | fermentas | R0191 | ||
| DpnI or DpnI Fast digest | fermentas | ER1701 | ||
| primers | invitrogen | desalted |
References
- Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. QuikChange site-directed mutagenesis. Strategies. 9, 3-4 (1996).
