Imagerie de cellules vivantes de la F-actine fluorescente Dynamics via chatoiement de microscopie (FSM)
Summary
Sélection, la microinjection, et l'imagerie de fluorescence étiqueté F-actine fluorescente via chatoiement de microscopie (FSM).
Abstract
Dans ce protocole, nous décrivons l'utilisation de la microscopie fluorescente chatoiement (FSM) pour capturer des images haute résolution de la dynamique de l'actine dans les cellules PtK1. Un avantage unique de la FSM est sa capacité à capturer le mouvement et la cinétique chiffre d'affaires (montage / démontage) du réseau de la F-actine dans les cellules vivantes. Cette technique est particulièrement utile dans découlant des mesures quantitatives de F-actine dynamiques quand il est associé avec le logiciel de vision par ordinateur (qFSM). Nous décrivons la sélection, la micro-injection et la visualisation des sondes fluorescentes actine dans les cellules vivantes. Surtout, des procédures similaires sont applicables aux assemblées macomolecular visualisant les autres. FSM a été démontrée pour les microtubules, filaments intermédiaires, et des complexes d'adhérence.
Protocol
Discussion
Plusieurs facteurs clés sont indispensables pour réussir à obtenir des images de speckle, taches aussi bonne commencent et finissent avec la qualité de votre actine marqués par fluorescence. Un ratio élevé de l'étiquetage de teinture à l'actine monomère, autour de 0,4 à 0,7 veillera à ce que taches apparaissent lumineux et discret, tandis que la protéine marquée elle-même doit être soluble et libre de granulats. Tout aussi importante est la procédure la microinjection. Pour assurer l'homéos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le développement de qFSM est financé par le NIH U01 GM06230.
Materials
Injection buffer (IB)
50 mM potassium glutamate
0.5 M MgCl2 (APPENDIX 2A)
Store up to 2 years at −20° C
G-buffer
2 mM Tris⋅Cl, pH 8.0 (APPENDIX 2A)
0.2 mM CaCl2 (APPENDIX 2A)
Add just before use:
0.2 mM ATP (see recipe for 100 mM)
0.5 mM 2-mercaptoethanol
References
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