Живая изображений Сотовые Ф-актина Динамика через Флуоресцентный Спекл микроскопия (FSM)
Summary
Выбор, микроинъекции, и обработки изображений флуоресцентно меченных F-актин с помощью флуоресцентной микроскопии спекл (ФШМ).
Abstract
В этом протоколе описываются использование флуоресцентных Спекл микроскопия (FSM) для захвата изображений с высоким разрешением актина динамика в PtK1 клеток. Уникальное преимущество автомата является ее возможность захвата движения и оборот кинетики (сборка / разборка) из F-актин сети в живых клетках. Эта методика особенно полезна при выводе количественных измерений F-актин динамика в паре с компьютерного зрения программного обеспечения (qFSM). Мы описываем отбора, микроинъекции и визуализации флуоресцентных зондов актина в живых клетках. Важно отметить, что аналогичные процедуры, применимые к визуализации других сборок macomolecular. FSM был продемонстрирован на микротрубочки, промежуточные нити, и адгезию комплексов.
Protocol
Discussion
Несколько ключевых факторов имеют решающее значение для успешного получения спекл-изображений, каким бы хорошим крапинками начинаться и заканчиваться качество вашей флуоресцентно меченных актина. Высокий коэффициент маркировке красителей с актином мономера, расположенные вокруг 0,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Развитие qFSM финансируется за счет гранта NIH U01 GM06230.
Materials
Injection buffer (IB)
50 mM potassium glutamate
0.5 M MgCl2 (APPENDIX 2A)
Store up to 2 years at −20° C
G-buffer
2 mM Tris⋅Cl, pH 8.0 (APPENDIX 2A)
0.2 mM CaCl2 (APPENDIX 2A)
Add just before use:
0.2 mM ATP (see recipe for 100 mM)
0.5 mM 2-mercaptoethanol
References
- Waterman-Storer, C. Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).
- Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells. Science. 305, 1782-1786 (2004).
- Zhang, X. F., Schaefer, A. W., Burnette, D. T., Schoonderwoert, V. T., Forscher, P. Rho-dependent contractile responses in the neuronal growth cone are independent of classical peripheral retrograde actin flow. Neuron. 40, 931-944 (2003).
- Salmon, W. C., Adams, M. C., Waterman-Storer, C. M. Dual-wavelength fluorescent speckle microscopy reveals coupling of microtubule and actin movements in migrating cells. J Cell Biol. 158, 31-37 (2002).
- Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 361-387 (2006).
