يعيش التصوير خلية من طراز F - أكتين حيوية عن طريق الميكروسكوب الرقطة نيون (FSM)
Summary
الاختيار ، microinjection ، والتصوير من fluorescently المسمى F – أكتين عبر الفلورسنت رقطة المجهري (FSM).
Abstract
في هذا البروتوكول وصفنا استخدام الميكروسكوب الرقطة نيون (FSM) لالتقاط صور عالية الدقة للديناميات أكتين PtK1 في الخلايا. وهناك ميزة فريدة من FSM هو قدرته على التقاط الحركة ودوران حركية (التجميع / التفكيك) من شبكة من طراز F – أكتين داخل الخلايا الحية. هذه التقنية مفيدة بشكل خاص في القياسات الكمية المستمدة من طراز F – أكتين ديناميات عندما يقترن برامج الكمبيوتر الرؤية (qFSM). نحن تصف التحديد ، والتصور microinjection تحقيقات أكتين الفلورية في الخلايا الحية. الأهم من ذلك ، إجراءات مماثلة تنطبق على تصور macomolecular الجمعيات الأخرى. وقد ثبت عن FSM ميكروتثبول ، خيوط وسيطة ، والمجمعات الالتصاق.
Protocol
Discussion
عدة عوامل رئيسية هي حاسمة لنجاح رقطة الحصول على الصور ، الرقطة جيدة ولكن تبدأ وتنتهي مع نوعية أكتين الخاص fluorescently المسمى. وهناك نسبة عالية من العلامات صبغ لمونومر أكتين ، بتعيين حوالي 0،4-0،7 ضمان الرقطة ستظهر مشرق ومنفصلة ، في حين أن البروتين المسمى ذاتها ينبغي أن تكون…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويتم تمويل تطوير qFSM من U01 منحة المعاهد الوطنية للصحة GM06230.
Materials
Injection buffer (IB)
50 mM potassium glutamate
0.5 M MgCl2 (APPENDIX 2A)
Store up to 2 years at −20° C
G-buffer
2 mM Tris⋅Cl, pH 8.0 (APPENDIX 2A)
0.2 mM CaCl2 (APPENDIX 2A)
Add just before use:
0.2 mM ATP (see recipe for 100 mM)
0.5 mM 2-mercaptoethanol
References
- Waterman-Storer, C. Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).
- Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells. Science. 305, 1782-1786 (2004).
- Zhang, X. F., Schaefer, A. W., Burnette, D. T., Schoonderwoert, V. T., Forscher, P. Rho-dependent contractile responses in the neuronal growth cone are independent of classical peripheral retrograde actin flow. Neuron. 40, 931-944 (2003).
- Salmon, W. C., Adams, M. C., Waterman-Storer, C. M. Dual-wavelength fluorescent speckle microscopy reveals coupling of microtubule and actin movements in migrating cells. J Cell Biol. 158, 31-37 (2002).
- Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 361-387 (2006).
