Floresan üzerinden F-aktin Dynamics Canlı Hücre Görüntüleme speckle Mikroskopi (FSM)
Summary
Seçimi, mikroenjeksiyon ve görüntüleme floresan ile F-aktin floresan etiketli (FSM) mikroskopi speckle.
Abstract
Bu protokolde Floresan kullanımı PtK1 hücreleri aktin dinamiklerinin yüksek çözünürlüklü görüntü yakalamak için Mikroskopi (FSM) speckle açıklar. FSM eşsiz bir avantajı canlı hücrelerin içinde F-aktin ağ hareketini ve ciro kinetiği (montaj / demontaj) yakalamak için yeteneğidir. Bu teknik, bilgisayar vizyonu yazılım (qFSM) ile eşleştirilmiş, F-aktin dinamiklerinin kantitatif ölçümler çıkarmada yararlıdır. Biz seçimi, mikroenjeksiyon ve canlı hücrelerin floresan aktin probları görselleştirme açıklar. Daha da önemlisi, benzer işlemler, diğer macomolecular meclisleri görselleştirmek için geçerli. FSM mikrotübül, ara filamentler, ve yapışma kompleksleri için kanıtlanmıştır.
Protocol
Discussion
Başarıyla speckle görüntüler elde etmek için birkaç anahtar faktör çok önemlidir, ancak iyi benekler floresan etiketli aktin kalitesi ile başlar ve biter. Etiketli protein kendisi çözünür ve agrega ücretsiz olmalıdır 0,7 0,4 çevresinde aktin monomeri, boya, yüksek bir etiketleme oranı, benekler ve ayrık parlak görünmesini sağlayacaktır. Aynı derecede önemli olan mikroenjeksiyon işlemi. Normal hücre homeostazının sağlamak için (ve hayatta kalma), hücreler tanıtan etiketli protein konsa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
QFSM gelişimi, Ulusal Sağlık Enstitüsü, hibe u01 GM06230 tarafından finanse edilmektedir.
Materials
Injection buffer (IB)
50 mM potassium glutamate
0.5 M MgCl2 (APPENDIX 2A)
Store up to 2 years at −20° C
G-buffer
2 mM Tris⋅Cl, pH 8.0 (APPENDIX 2A)
0.2 mM CaCl2 (APPENDIX 2A)
Add just before use:
0.2 mM ATP (see recipe for 100 mM)
0.5 mM 2-mercaptoethanol
References
- Waterman-Storer, C. Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).
- Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells. Science. 305, 1782-1786 (2004).
- Zhang, X. F., Schaefer, A. W., Burnette, D. T., Schoonderwoert, V. T., Forscher, P. Rho-dependent contractile responses in the neuronal growth cone are independent of classical peripheral retrograde actin flow. Neuron. 40, 931-944 (2003).
- Salmon, W. C., Adams, M. C., Waterman-Storer, C. M. Dual-wavelength fluorescent speckle microscopy reveals coupling of microtubule and actin movements in migrating cells. J Cell Biol. 158, 31-37 (2002).
- Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 361-387 (2006).
