Préparation des Aplysie Sensori-motrice cultures de cellules neuronales
Summary
Des cultures primaires de<em> Aplysie</em> Sensori-motrices des neurones fournir une préparation modèle pour étudier la formation des synapses et la plasticité synaptique<em> In vitro</em>. Cette vidéo montre l'identification et la microdissection des neurones sensoriels et moteurs de<em> Aplysie</emGanglions> ainsi que les méthodes pour établir et maintenir sensori-motrices des neurones en culture.
Abstract
Le système nerveux de l'aplysie californica mollusque marin est relativement simple, composé d'environ 20 000 neurones. Les neurones sont de grande taille (jusqu'à 1 mm de diamètre) et identifiable, avec des tailles différentes, des formes, positions et les pigmentations et les corps cellulaires sont exposées à l'extérieur en cinq ganglions jumelé distribués dans tout le corps de l'animal. Ces propriétés ont permis aux enquêteurs de délimiter les circuits qui sous-tendent les comportements spécifiques chez l'animal 1. La connexion monosynaptique entre les neurones sensoriels et moteurs est une composante centrale du réflexe de retrait des branchies chez l'animal, un simple réflexe de défense dans lequel l'animal se retire de ses branchies, en réponse à une stimulation tactile du siphon. Ce réflexe subit des formes d'apprentissage non-associatif et associatif, y compris la sensibilisation, l'accoutumance et le conditionnement classique. Un avantage particulier à l'étude de la plasticité synaptique, la synapse sensori-moteur peut être reconstituée dans la culture, où bien caractérisés stimuli suscitent des formes de plasticité qui ont des corrélats directe dans le comportement de l'animal 2,3. Plus précisément, l'application de la sérotonine produit un renforcement synaptique qui, selon le protocole d'application, dure quelques minutes (à court terme de facilitation), heures (à moyen terme de facilitation) ou jours (facilitation à long terme). En revanche, l'application de la FMRFamide émetteur peptide produit un affaiblissement synaptique ou la dépression qui, selon le protocole d'application, peut durer de quelques minutes à plusieurs jours (dépression à long terme). La grande taille des neurones permet d'enregistrer l'électrode répétées forte de la force synaptique au cours des périodes de jours ensemble avec microinjection de vecteurs d'expression, et d'autres composés siRNA pour cibler des cascades de signalisation et les molécules et ainsi d'identifier les étapes moléculaires et cellulaires biologiques qui sous-tendent les changements de l'efficacité synaptique.
Un avantage supplémentaire du système de culture de l'aplysie vient du fait que les neurones de démontrer la spécificité des synapses dans la culture 4,5. Ainsi, les neurones sensoriels ne forment des synapses avec eux-mêmes (autapses) ou avec d'autres neurones sensoriels, et ils ne forment des synapses avec des non-cibles identifiés dans les neurones moteurs de la culture. Les varicosités, les sites de contact synaptiques entre les neurones sensoriels et moteurs, sont assez grandes (2-7 microns de diamètre) pour permettre la formation des synapses (ainsi que des changements dans la morphologie synaptique) avec les neurones moteurs cible à être étudiés au niveau du microscope optique.
Dans cette vidéo, nous démontrons chaque étape de la préparation des cultures de neurones sensori-moteurs, y compris les adultes et les anesthésier aplysie juvénile, disséquant leurs ganglions, la digestion de la protéase du ganglion, l'enlèvement du tissu conjonctif par microdissection, l'identification des deux neurones sensoriels et moteurs et l'enlèvement de chaque type cellulaire par microdissection, le placage du neurone moteur, plus du neurone sensoriel et la manipulation des neurites sensoriels pour former le contact avec la culture des neurones moteurs.
Protocol
Discussion
La bonne préparation des aplysie sensori-motrices des cultures a une courbe d'apprentissage assez lent, car il implique le développement de la motricité fine associée à la microdissection et la manipulation des neurones individuels vue à travers un stéréomicroscope. Dans notre expérience, il faut environ 1-3 semaines de pratique pour obtenir saine isolées neurones sensoriels en culture et une semaine supplémentaire 1-3 pour apprendre à paire neurones sensoriels avec les neurones moteurs. Nous av…
Acknowledgements
Le travail en laboratoire impliquant la mise en culture des neurones aplysie est financé par la liste des NIH et le NIH R01 R21MH077921.
Materials
Solutions needed for culture
- 0.35 M MgCl2, stored at room temperature, used for anesthesia.
- Poly-L-lysine solution, Sigma: P-1524, MW >300,000, made in 0.1M Sodium Borate pH8.2 to 0.5mg/ml solution. Vortex well and filter sterilize through a 0.22 μm filter, store it at 4C°. Do not freeze-thaw.
- L-15 Medium powder (Leibovitz) (Sigma: L4386) supplemented with the salts as below to make 1 liter
Add ddH20 to 1 liter. The pH should be about 7.4-7.5, add 10ml of 100X Pen/Strep solution, and filter-sterilize through a 0.22 µm filter. Store at 4C0 for no longer than 1 month.L-15 powder 13.8g NaCl 15.4 g D-Glucose 6.24 g MgSO4•7H20 6.45g KCl 350 mg NaHCO3 170 mg MgCl2•6H2O 5.49 g CaCl2•2H2O 1.43g HEPES 3.53g - Protease digestion solution: 1% Protease IX (1unit/mg) is made in L15 (supplemented with salts as above) or in ASW immediately before use, filter-sterilized through a 0.22 µm Millipore. 5mls should be enough for the ganglia from two animals (make sure the ganglia are completely immersed in protease solution). Sigma has reported that they will discontinue selling Protease IX. A substitute protease is: Dispase II (Roche Applied Science catalog # 04942078001).
- Culture medium. Immediately prior to preparing cultures, thaw a 10 ml aliquot of hemolymph and mix it with 10 mls of L15 (supplemented with salts as above) to make 20mls culture medium. Add 200 μl of 200mM L- Glutamine, mix well and use for preparing cultures. This medium should be prepared fresh each time cultures are made.
- Artificial Seawater can be made from Instant Ocean (Aquarium Systems, Mentor, OH) or as follows: 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 30 mM MgCl2(6H2O), 20 mM MgSO4, 10 mM CaCl2(2H2O), 10 mM HEPES, with pH adjusted to 7.4.
References
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