Preparación de Aplysia Sensorio-motor culturas de células neuronales
Summary
Cultivos primarios de<em> Aplysia</em> Sensorio-motor neuronas proporcionar una preparación de modelos para el estudio de la formación de sinapsis y la plasticidad sináptica<em> In vitro</em>. Este video muestra la identificación y microdisección de las neuronas sensoriales y motoras de<em> Aplysia</em> Ganglios, así como los métodos para establecer y mantener sensorio-motor neuronas en cultivo.
Abstract
El sistema nervioso del molusco marino Aplysia californica es relativamente simple, que consiste en aproximadamente 20.000 neuronas. Las neuronas son grandes (hasta 1 mm de diámetro) e identificable, con distintos tamaños, formas, posiciones y pigmentaciones, y los cuerpos de las células son expuestas externamente en los ganglios pares cinco marcas distribuidas por todo el cuerpo del animal. Estas propiedades han permitido a los investigadores para delimitar los circuitos subyacentes comportamientos específicos en los animales 1. La conexión entre monosináptica neuronas sensoriales y motoras es un componente central del reflejo de enmalle a la retirada del animal, un simple reflejo defensivo en el que el animal se retira de su enmalle en respuesta a la estimulación táctil del sifón. Este reflejo se somete a las formas de aprendizaje no asociativo y asociativo, incluyendo la sensibilización, la habituación y condicionamiento clásico. De beneficio particular para el estudio de la plasticidad sináptica, las sinapsis sensorio-motor puede ser reconstituida en la cultura, donde bien caracterizados estímulos provocan las formas de plasticidad que tienen correlatos directos en el comportamiento de los animales 2,3. Específicamente, la aplicación de la serotonina produce un reforzamiento sináptico que, según el protocolo de aplicación, tiene una duración de minutos (a corto plazo de facilitación), horas (a medio plazo de facilitación) o días (facilitación de largo plazo). Por el contrario, la aplicación de la FMRFamide transmisor péptido produce un debilitamiento o la depresión sináptica que, según el protocolo de aplicación, pueden durar desde minutos a días (depresión a largo plazo). El gran tamaño de las neuronas permite la grabación repetidas electrodo afilado de la fuerza sináptica durante períodos de días, junto con la microinyección de vectores de expresión, siRNAs y otros compuestos específicos de cascadas de señalización y de las moléculas y así identificar los pasos de biología molecular y celular que subyacen a los cambios en la eficacia sináptica.
Una ventaja adicional del sistema de cultivo Aplysia viene del hecho de que las neuronas sinapsis demostrar la especificidad de la cultura en 4,5. Así, las neuronas sensoriales no forman sinapsis con ellos mismos (autapses) o con otras neuronas sensoriales, ni forman sinapsis con las neuronas no son objeto de automotor identificado en la cultura. Las varices, los sitios de contacto sináptico entre las neuronas sensoriales y motoras, son lo suficientemente grandes (2-7 micras de diámetro) para permitir la formación de sinapsis (así como cambios en la morfología sináptica) con las neuronas motoras de destino para ser estudiado a nivel microscópico de luz.
En este vídeo, que muestran cada paso de la preparación de sensorio-motor cultivos de neuronas, incluyendo adultos y anestesiar Aplysia juvenil, la disección de sus ganglios, la digestión de la proteasa de los ganglios, la eliminación del tejido conjuntivo por microdisección, la identificación de dos neuronas sensoriales y motoras y la eliminación de cada tipo celular por microdisección, revestimiento de la neurona motora, además de la neurona sensorial y la manipulación de las neuritas sensorial para formar el contacto con el cultivo de neuronas motoras.
Protocol
Discussion
La preparación exitosa de Aplysia sensorio-motor culturas tiene una curva de aprendizaje un poco lento, ya que implica el desarrollo de las habilidades motoras finas relacionadas con microdisección y la manipulación de las neuronas individuales han visto a través de un microscopio estereoscópico. En nuestra experiencia, lleva semanas aproximadamente 1-3 de la práctica para obtener saludable neuronas sensoriales aisladas en la cultura y un adicional de 1-3 semanas para aprender a par de las neuronas sensor…
Acknowledgements
Trabajar en el laboratorio implican el cultivo de neuronas de Aplysia es financiado por el NIH lista R01 y R21MH077921 NIH.
Materials
Solutions needed for culture
- 0.35 M MgCl2, stored at room temperature, used for anesthesia.
- Poly-L-lysine solution, Sigma: P-1524, MW >300,000, made in 0.1M Sodium Borate pH8.2 to 0.5mg/ml solution. Vortex well and filter sterilize through a 0.22 μm filter, store it at 4C°. Do not freeze-thaw.
- L-15 Medium powder (Leibovitz) (Sigma: L4386) supplemented with the salts as below to make 1 liter
Add ddH20 to 1 liter. The pH should be about 7.4-7.5, add 10ml of 100X Pen/Strep solution, and filter-sterilize through a 0.22 µm filter. Store at 4C0 for no longer than 1 month.L-15 powder 13.8g NaCl 15.4 g D-Glucose 6.24 g MgSO4•7H20 6.45g KCl 350 mg NaHCO3 170 mg MgCl2•6H2O 5.49 g CaCl2•2H2O 1.43g HEPES 3.53g - Protease digestion solution: 1% Protease IX (1unit/mg) is made in L15 (supplemented with salts as above) or in ASW immediately before use, filter-sterilized through a 0.22 µm Millipore. 5mls should be enough for the ganglia from two animals (make sure the ganglia are completely immersed in protease solution). Sigma has reported that they will discontinue selling Protease IX. A substitute protease is: Dispase II (Roche Applied Science catalog # 04942078001).
- Culture medium. Immediately prior to preparing cultures, thaw a 10 ml aliquot of hemolymph and mix it with 10 mls of L15 (supplemented with salts as above) to make 20mls culture medium. Add 200 μl of 200mM L- Glutamine, mix well and use for preparing cultures. This medium should be prepared fresh each time cultures are made.
- Artificial Seawater can be made from Instant Ocean (Aquarium Systems, Mentor, OH) or as follows: 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 30 mM MgCl2(6H2O), 20 mM MgSO4, 10 mM CaCl2(2H2O), 10 mM HEPES, with pH adjusted to 7.4.
References
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