اشتقاق خلايا الجذعية المكونة للدم من الفئران خلايا الجذعية الجنينية
Summary
تفاصيل هذا البروتوكول اشتقاق زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم من الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) ، والحقن في وقت لاحق في الفئران المتلقي المشع القاتلة. باختصار ، كانت متباينة ESC كهيئات مضغي الشكل ، والذي يصاب بعد ذلك مع HoxB4 فيروسات وشارك في تربيتها مع OP9 الخلايا اللحمية والسيتوكينات المكونة للدم.
Abstract
وتعرف الخلايا الجذعية في زنزانة مع القدرة على تجديد الذات على حد سواء ، وتوليد سلالة مختلفة متعددة. يتم اشتقاق الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) من الكيسة الجنين في وقت مبكر والمحفزة في قدرة differentiative. جعلت إمكاناتها differentiative العظمى منهم تركيز الكثير من الأبحاث تركز على استنتاج كيفية اقناعهم لتوليد أنواع الخلايا مفيدة سريريا. وقد تم مؤخرا بنجاح اشتقاق الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) من الماوس ESC المنجز ويمكن تصور هذا البروتوكول في الفيديو. وتستخدم HSC ، يمكن القول إن سكان الخلية الأكثر استغلالا سريريا ، لعلاج عدد لا يحصى من الأمراض الخبيثة للدم واضطرابات. ومع ذلك ، العديد من المرضى التي قد تستفيد من العلاج HSC عدم الوصول إلى الجهات المانحة المناسبة. يمكن ESC توفير مصدر بديل للشهادة الثانوية العامة لهؤلاء المرضى. بروتوكول التالية تضع الأساس الذي يمكن من خلاله درس ESC – HSC وإعلام جهودا لعزل HSC من ESC الإنسان. في هذا البروتوكول ، ويتم التمييز ESC كهيئات مضغي الشكل (EBS) لمدة 6 أيام في المتاحة تجاريا تمايز الأمثل المصل بعد فرزهم للدم. EBS يتم فصلها ثم المصابين HoxB4 فيروسات. ومطلي المصابة EB – مشتقة الخلايا على OP9 سدى ، وهو خط نخاع العظم الخلايا المشتقة من انسجة من calvaria / – M – CSF — الفئران ، وشارك في تربيتها في حضور تعزيز السيتوكينات تكون الدم لمدة عشرة أيام. خلال هذه الثقافة المشتركة ، وتوسيع الخلايا المصابة بشكل كبير ، مما أدى إلى توليد مجموعة غير متجانسة من 100s من الملايين من الخلايا. ويمكن بعد هذه الخلايا يمكن استخدامها لانقاذ الفئران وإعادة المشع القاتلة.
Protocol
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice | Animal | Taconic Farm | ||
| Plate shaker | Tool | VWR | 33998-360 | Orbital Shaker by Ikaworks |
| Multi-channel pipettor | Tool | VWR | 15000-174 | ePet by BioHit |
| ES trypsin | Reagent | Invitrogen | 15090-046 | 0.25% Trypsin in PBS |
| Standard trypsin | Reagent | Invtrogen | 25300-062 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| PBS | Buffer | Invitrogen | 20012-027 | |
| Enzyme-free dissociation buffer | Buffer | Invitrogen | 13151-014 | |
| Dissociation enzyme mix | Buffer | Invitrogen | 17104-019 | 500 mg Collagenase IV |
| Hyaluronidase | Reagent | Sigma | H2126 | freeze in 500 uL aliquots and avoid repeated freezing and thawing. |
| DNAse | Reagent | Sigma | D4527 | |
| DMEM | Invitrogen | 10-017CV | ||
| Protamine sulfate | Reagent | Sigma | P3369 | 8 ug/mL |
| EB differentiation media | medium | Please view recipe on attached Protocol.doc | ||
| 10% IMDM | medium | Please view recipe on attached Protocol.doc | ||
| 10% IMDM+cytokines | medium | Please view recipe on attached Protocol.doc | ||
| 20% anti-MEM | Please view recipe on attached Protocol.doc |
