גזירת בתאי גזע hematopoietic מ Murine בתאי גזע עובריים
Summary
זה פרוטוקול הפרטים גזירת להשתלה בתאי גזע hematopoietic מתאי גזע עובריים של עכבר (ESC) הזרקת הבאים שלהם לעכברים הנמען מוקרן קטלנית. בקצרה, הם ESC להבדיל גופים embryoid, אשר נגועים אז עם HoxB4 retroviral ושיתוף תרבותי עם OP9 תאים סטרומה וציטוקינים hematopoietic.
Abstract
תא גזע מוגדר בתא עם היכולת הן עצמית לחדש וליצור בידול צאצאים מרובים. לתאי גזע עובריים (ESC) נגזרות הבלסטוציסט העובר מוקדם הם pluripotent ביכולת differentiative. פוטנציאל עצום differentiative שלהם הפכה אותם למוקד של מחקר רב התרכזו והסיק איך לפתות אותם כדי לייצר תאים מסוגים שימושי קלינית. גזרה מוצלחת של בתאי גזע hematopoietic (HSC) מהעכבר ESC לאחרונה הושג וניתן דמיינו בפרוטוקול הווידאו הזאת. HSC, ניתן לטעון את האוכלוסייה תא ביותר לנצל קלינית, משמשות לטיפול מספר עצום של ממאירויות והפרעות hematopoietic. עם זאת, חולים רבים שעשויים להפיק תועלת מטיפול HSC חוסר גישה תורמים מתאימים. ESC יכול לספק מקור חלופי של HSC עבור חולים אלו. פרוטוקול הבאה קובעת הבסיס שממנו ESC-HSC ניתן ללמוד ולהודיע המאמצים לבודד HSC מ ESC האדם. בפרוטוקול זה, ESC הם להבדיל גופים embryoid (EBS) במשך 6 ימים בידול זמינים מסחרית מראש לגילוי נסיוב hematopoietic אופטימלית. EBS הם ניתק אז נגוע HoxB4 retroviral. אינפקטד EB-derived תאים מצופה על OP9 stroma, מח עצם קו סטרומה תא נגזר מכסה הגולגולת של M-CSF-/ – עכברים, ושיתוף בתרבית בנוכחות hematopoiesis קידום ציטוקינים למשך עשרה ימים. במהלך תרבות משותפת זו, תאים נגועים להרחיב באופן משמעותי, וכתוצאה מכך הדור בריכה הטרוגנית של 100s של מיליוני תאים. תאים אלה לאחר מכן ניתן להשתמש כדי עכברים הצלה מחדש מוקרן קטלנית.
Protocol
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice | Animal | Taconic Farm | ||
| Plate shaker | Tool | VWR | 33998-360 | Orbital Shaker by Ikaworks |
| Multi-channel pipettor | Tool | VWR | 15000-174 | ePet by BioHit |
| ES trypsin | Reagent | Invitrogen | 15090-046 | 0.25% Trypsin in PBS |
| Standard trypsin | Reagent | Invtrogen | 25300-062 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| PBS | Buffer | Invitrogen | 20012-027 | |
| Enzyme-free dissociation buffer | Buffer | Invitrogen | 13151-014 | |
| Dissociation enzyme mix | Buffer | Invitrogen | 17104-019 | 500 mg Collagenase IV |
| Hyaluronidase | Reagent | Sigma | H2126 | freeze in 500 uL aliquots and avoid repeated freezing and thawing. |
| DNAse | Reagent | Sigma | D4527 | |
| DMEM | Invitrogen | 10-017CV | ||
| Protamine sulfate | Reagent | Sigma | P3369 | 8 ug/mL |
| EB differentiation media | medium | Please view recipe on attached Protocol.doc | ||
| 10% IMDM | medium | Please view recipe on attached Protocol.doc | ||
| 10% IMDM+cytokines | medium | Please view recipe on attached Protocol.doc | ||
| 20% anti-MEM | Please view recipe on attached Protocol.doc |
