从小鼠胚胎干细胞的造血干细胞的推导

Summary

该协议的细节从小鼠胚胎干细胞（ESC），并随后注入到致死剂量照射的的受体小鼠的造血干细胞移植的推导。简言之，电子调速器是有区别的胚体，然后用逆转录病毒HOXB4 OP9基质细胞和造血细胞因子共同培养的感染。

Abstract

干细胞被定义为一个有能力的细胞自我更新和产生多个不同的后代。胚胎干细胞（ESC）上都来源于早期胚胎的囊胚differentiative能力的多能干。其巨大的differentiative潜力，使他们推断如何哄他们产生临床上有用的细胞类型为中心的许多研究的重点。成功，造血干细胞从小鼠ESC（HSC）的推导，最近已经完成，可以在这个视频协议的可视化。 HSC的，可以说是最临床上利用的细胞群，是用来治疗无数的造血系统恶性肿瘤和障碍。然而，许多患者可能会受益于HSC的治疗得不到合适的捐赠者。 ESC键可以为这些患者提供替代来源的HSC。以下协议，建立了从ESC – HSC，可以研究，并告知努力找出人类胚胎的HSC的基线。在这个协议中，ESC 6天市售的血清前筛选最佳的造血分化的胚状体（EBS）是有区别的。分化是再分解，与逆转录病毒HOXB4感染。感染的EB -源性细胞接种于OP9基质，派生从颅骨的M – CSF – / – 小鼠骨髓基质细胞系，并合作培养中存在的十天，促进细胞因子的造血。在这种合作文化，被感染的细胞大大扩大，在一代人造成了数百万个细胞100S异构池。然后，这些细胞可以用于救援和重建致死剂量照射的小鼠。

Protocol

分化的胚胎干细胞通过用ESC胰蛋白酶处理的胚胎干细胞（ESC）上收集的附近汇合瓶中。 重悬细胞分化媒体5毫升，并转移到非明胶涂层的T25。 37 ° 45分钟的彗星。检索上清，通过离心收集细胞。 注：小鼠胚胎成纤维细胞从ESC文化（MEFs）容易附着到非明胶涂层的T25，从而从文化耗尽在此期间电镀步骤。 如果你不培养你的人事编制小组委员会上MEFs，你可以跳过前板</…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice	Animal	Taconic Farm
Plate shaker	Tool	VWR	33998-360	Orbital Shaker by Ikaworks
Multi-channel pipettor	Tool	VWR	15000-174	ePet by BioHit
ES trypsin	Reagent	Invitrogen	15090-046	0.25% Trypsin in PBS
Standard trypsin	Reagent	Invtrogen	25300-062	0.05% Trypsin-EDTA
PBS	Buffer	Invitrogen	20012-027
Enzyme-free dissociation buffer	Buffer	Invitrogen	13151-014
Dissociation enzyme mix	Buffer	Invitrogen	17104-019	500 mg Collagenase IV
Hyaluronidase	Reagent	Sigma	H2126	freeze in 500 uL aliquots and avoid repeated freezing and thawing.
DNAse	Reagent	Sigma	D4527
DMEM		Invitrogen	10-017CV
Protamine sulfate	Reagent	Sigma	P3369	8 ug/mL
EB differentiation media	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM+cytokines	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
20% anti-MEM				Please view recipe on attached Protocol.doc