Live-Präparation Drosophila Embryos: Optimierte Verfahren für das Screening Mutant Sammlungen von Antikörper-Färbung
Summary
Wir beschreiben eine optimierte Protokoll zur Erzeugung von "Filet" Zubereitungen von Drosophila Embryonen von bestimmten Genotypen. Dieses Protokoll ermöglicht die effiziente Durchführung einer Vielzahl von genetischen Screens. Es ermöglicht auch exzellente Visualisierung von Strukturen in den späten Embryo.
Abstract
Drosophila-Embryos zwischen den Stufen 14 und 17 der Embryonalentwicklung kann leicht zerlegt werden, um "Filet" Vorbereitungen zu generieren. In diese Vorbereitungen, läuft das zentrale Nervensystem in der Mitte und wird vom Körper Wänden flankiert. Viele verschiedene Phänotypen untersucht worden mit solchen Präparaten. In den meisten Fällen wurden die Filets von Dissektion der Antikörper-gefärbten festen ganze-mount Embryonen erzeugt. Diese "festen Dissektionen" haben einige Nachteile. Sie sind zeitaufwändig ausführen, und es ist schwierig, Mutante (GFP-negativ) Embryonen aus Beständen, in denen Mutationen auf GFP-Balancer-Chromosomen erhalten bleiben sortieren. Seit 2002 hat unsere Gruppe die Durchführung Mangel und ektopische Expression Bildschirme Liganden für Orphan-Rezeptoren zu identifizieren. Um dies zu tun, haben wir gestrafft Protokolle für die Live-Embryo Dissektion und Antikörper-Färbung von Sammlungen mit Hunderten von symmetrischen Leitungen. Wir haben festgestellt, dass es erheblich effizienter ist, Phänotypen in großen Sammlungen von Vorräten leben Dissektion als durch feste Präparation zu untersuchen. Mit der hier beschriebene Protokoll kann ein einziger trainiert einzelnen Bildschirm bis zu 10 Zeilen pro Tag für Phänotypen, die Prüfung 4-7 mutierten Embryonen aus jeder Zeile unter einem zusammengesetzten Mikroskop. Dies ermöglicht die Identifikation von Mutationen verleihen subtil, low-Penetranz Phänotypen, da bis zu 70 hemisegments pro Zeile bei hoher Vergrößerung mit einem 40x Wasser-Immersions-Objektiv erzielt.
Protocol
Discussion
Wir hoffen, dass dieses Video-Demonstration hat unsere Methoden für Live-Embryo Dissektion und Färbung ausreichend detailliert, dass sie nun leicht durch eine Person, die eine gewisse Erfahrung in Drosophila-Genetik und Embryologie hat ausgeführt werden angezeigt. Natürlich wird erhebliche Praxis noch erforderlich, vor allem für die Sektionen selbst zu sein. Nach unserer Erfahrung wird jede Person, die die Live-Dissektion Methoden lernt schaffen eine differenzierte Dissektion Protokoll, dass ihm / ihr die …
Acknowledgements
Wir danken Nicki Fox und Aloisia Schmid für ihre Beiträge zur Entwicklung dieser Protokolle. Diese Arbeit wurde durch ein NIH RO1 gewähren KZ, NS28182 unterstützt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Borosilicate Tubing With Filament | Sutter Instrument | BF120-60-10 | ||
| Narishige model PC-10 needle puller | Narishige | Tubes pulled using a heater level of 58.9 |
References
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).
- Desai, C. J., Gindhart, J. G., Goldstein, L. S., Zinn, K. Receptor tyrosine phosphatases are required for motor axon guidance in the Drosophila embryo. Cell. 84, 599-609 (1996).
- Sun, Q., Schindelholz, B., Knirr, M., Schmid, A., Zinn, K. Complex genetic interactions among four receptor tyrosine phosphatases regulate axon guidance in Drosophila. Molecular and cellular neurosciences. 17, 274-291 (2001).
- Schmid, A., Schindelholz, B., Zinn, K. Combinatorial RNAi: a method for evaluating the functions of gene families in Drosophila. Trends in neurosciences. 25, 71-74 (2002).
- Fox, A. N., Zinn, K. The heparan sulfate proteoglycan syndecan is an in vivo ligand for the Drosophila LAR receptor tyrosine phosphatase. Curr Biol. 15, 1701-1711 (2005).
