라이브 해부 Drosophila 태아 : 항체 스테 이닝에 의해 돌연변이 컬렉션을 검사 늘씬한 방법
Summary
우리는 특정 genotypes의 Drosophila의 배아의 "등심"준비 창출을위한 능률적인 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 유전자 화면의 다양한 효율적인 실행을 허용합니다. 또한 후반 배아의 구조 우수 시각화 수 있습니다.
Abstract
배아 발달의 단계 14 17 사이의 Drosophila의 배아는 쉽게 "등심"준비를 생성하기 위해 해부를하실 수 있습니다. 이러한 준비에서, 중추 신경 시스템은 중앙을 실행하고, 신체 벽 둘러싸인 있습니다. 여러 phenotypes는 그러한 준비를 사용하여 검사하고 있습니다. 대부분의 경우 필레는 항체 묻은 고정 전체 마운트 배아의 절개로 생성되었습니다. 이러한 "고정 해부는"그러나 일부 단점이 있습니다. 그들은 실행 시간이 소비되며,이 변이는 GFP 밸런서 염색체 이상 유지하는 주식에서 돌연변이 (GFP – 음수) 배아를 정렬하기가 어렵습니다. 2002 년부터, 우리 그룹은 고아 수용체에 대한 리간드를 식별 결핍 및 이소성 표현 화면을 실시하고 있습니다. 이 작업을 수행하기 위해서는, 우리가 사는 배아 해부하고 균형잡힌 라인의 수백을 포함하는 컬렉션의 항체 염색법에 대한 능률 프로토콜을 개발했습니다. 우리는 고정 절개로보다 라이브 절개로 주식의 대규모 컬렉션에 phenotypes을 검토하기 위해 상당히 더 효율적이라고 결론을 내렸다있다. 프로토콜 여기에서 설명한을 사용하여, 하나의 훈련 개인은 복합 현미경으로 각 라인 4-7 돌연변이 배아를 조사 phenotypes에 대해 하루에 10 라인까지 스크린 수 있습니다. 이렇게하면 한 줄에 최대 70 hemisegments가 40X 물 침지 렌즈 높은 배율의 점수이기 때문에 미묘한, 낮은 penetrance phenotypes를 부여 변이의 식별.
Protocol
Discussion
우리는이 비디오 데모들은 지금 즉시 Drosophila 유전 발생학의 경험을 가진 사람에 의해 실행될 수있는 자료에 대해 충분하고 자세하게 사는 배아 해부와 얼룩을위한 방법을 표시했다 바랍니다. 물론, 상당한 연습은 여전히 주로 해부 자신을 위해 필요합니다. 우리의 경험에서 라이브 절개 방법을 배우는 모든 사람이 그 / 그녀가 가장 빠르게 고품질의 못하였 느니라 해부를 생성할 수 ?…
Acknowledgements
우리는이 프로토콜을 개발하기 위해 공헌 니키 폭스 Aloisia 슈미트 감사드립니다. 이 작품은 KZ, NS28182하는 NIH RO1 부여에 의해 지원되었다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Borosilicate Tubing With Filament | Sutter Instrument | BF120-60-10 | ||
| Narishige model PC-10 needle puller | Narishige | Tubes pulled using a heater level of 58.9 |
References
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- Desai, C. J., Gindhart, J. G., Goldstein, L. S., Zinn, K. Receptor tyrosine phosphatases are required for motor axon guidance in the Drosophila embryo. Cell. 84, 599-609 (1996).
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- Schmid, A., Schindelholz, B., Zinn, K. Combinatorial RNAi: a method for evaluating the functions of gene families in Drosophila. Trends in neurosciences. 25, 71-74 (2002).
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