Geoptimaliseerde fibrinegel Bead Assay voor de Studie van Angiogenese

Summary

Deze video toont het protocol van een in vitro angiogenese test die recapituleert verschillende stadia van angiogenese. Time-lapse beelden van kiemen, lumen vorming, vertakking en anastomose – belangrijkste kenmerken van angiogenese – worden weergegeven.

Abstract

Angiogenese is een complexe multi-step proces, waarbij, in antwoord op angiogene stimuli, nieuwe schepen worden gemaakt van de bestaande bloedvaten. Deze stappen zijn: afbraak van de basale membraan, proliferatie en migratie (ontspruiten) van endotheelcellen (EC) in de extracellulaire matrix, de uitlijning van de EC in de koorden, vertakking, lumen vorming, anastomose, en de vorming van een nieuwe kelder membraan. Velen in vitro testen zijn ontwikkeld om dit proces te bestuderen, maar de meeste alleen maar na te bootsen bepaalde stadia van de angiogenese, en morfologisch de schepen binnen de tests vaak niet lijken op schepen in vivo. Op basis van eerder werk van Nehls en Drenckhahn, hebben we een geoptimaliseerd in vitro angiogenese-test dat de menselijke navelstreng EG en fibroblasten gebruikt. Dit model recapituleert alle van de belangrijkste vroege stadia van angiogenese en, belangrijker nog, de schepen weer te geven patent intercellulaire lumen, omringd door gepolariseerd EC. EG worden gecoat op cytodex microdragers en ingebed in een fibrine gel. Fibroblasten zijn gelaagd op de top van de gel, waar zij nodig oplosbare factoren die de bevordering van EG-ontspruit uit het oppervlak van de kralen. Na een aantal dagen, talloze schepen aanwezig zijn die gemakkelijk kunnen worden waargenomen onder fase-contrast-en time-lapse microscopie. Deze video toont de belangrijkste stappen bij het opzetten van deze culturen.

Protocol

VOORBEREIDEN CELLEN Brengen HUVEC en fibroblasten in M199/10% FBS / Pen-Strep (1:100) 1-2 dagen voor de kralen. Schakelaar middellange tot EGM-2 (Clonetics) de dag voor beading voor HUVEC en de dag voor inbedding van fibroblasten. Een concentratie van ~ 400 HUVEC per kraal is nodig. 20.000 fibroblasten per goed is nodig. Coaten van de parels MET HUVEC – dag-1 Trypsinize HUVEC. Laat kralen om zich te vestigen (NIET CENTRIFUGE!)…

Discussion

Er is een groeiende consensus dat de drie-dimensionale (3D) in vitro angiogenese assays een model dat veel dichter bij de werkelijke omgeving in vivo dan kan worden bereikt met behulp van 2D-culturen aan te bieden. Het is duidelijk dat een superieure 3D-systemen moet reproduceerbaar zijn, en in staat zijn om een ​​aantal van de belangrijkste stappen van angiogenese na te bootsen. Terwijl verscheidene eerdere 3D-testen zijn ontwikkeld, veel van deze beide te gebruiken hard-to-verkrijgen van microvasculair cellen, of slechts recapituleren…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Cytodex-3 Beads	Reagent	Amersham Pharmacia	17-0485-01	10 g/bottle. 1. 0.5 g of dry beads are hydrated and swollen in 50 mL PBS (pH=7.4) for at least 3 hours at RT. Use a 50 mL tube and place it on the rocker. 2. Let the beads settle down (~ 15 min). Discard the supernatant and wash the beads for a few minutes in fresh PBS (50 mL). 3. Discard the PBS and replace with fresh PBS: 25 mL -> 20 mg/mL => 60000 beads/mL or 50 mL -> 10 mg/mL => 30000 beads/ mL 4. Place the bead suspension in a siliconized glass bottle (Windshield Wiper or Sigmacote). 5. Sterilize the beads by autoclaving for 15 min at 115C. 6. Store it at 4C.
Aprotinin	Reagent	Sigma	A-1153	10mg/bottle. Reconstitute lyophilized aprotinin at 4 U/mL in DI water. Sterile filter. Make aliquots of 1 mL each. Store at -20C.
Fibrinogen Type I	Reagent	Sigma	F-8630	1g. Dissolve 2 mg/mL fibrinogen in DPBS Note clottable protein % and adjust accordingly Heat in a 37C-water bath to dissolve the fibrinogen. Mix by inverting the tube. Do not vortex. Sterile filter through 0.22 um
Thrombin	Reagent	Sigma	T-3399	22 mg=1000 units. Reconstitute in sterile water at 50 U/mL. Make aliquots of 0.5 mL each. Store at -20C.