优化的纤维蛋白凝胶珠检测血管生成的研究

Summary

本视频演示了一个协议，在体外血管生成试验，概括的血管生成的几个阶段。显示图像时间的推移，发芽，管腔形成，分支和吻合 – 血管生成的关键特征 – 。

Abstract

血管生成是一个复杂的多步骤的过程，在血管生成刺激，新船都从现有的血管创建。这些步骤包括：降解基底膜，增殖和迁移（发芽）内皮细胞到细胞外基质，成线对齐欧共体（EC），分支，管腔形成，吻合术，并形成一个新的基底膜。在体外实验中有许多已开发研究这个过程，但大多只模仿血管生成的某些阶段，形态内检测的船只往往并不像在体内的船只。早期Nehls和Drenckhahn工作的基础上，我们进行了优化，利用人脐静脉EC和成纤维细胞在体外血管生成试验。这种模式概括所有的血管生成的关键早期阶段，重要的是，船只显示极化欧共体包围专利间流明。欧共体涂到cytodex微载体，并嵌入到纤维蛋白凝胶。成纤维细胞分层他们提供必要的可溶性因子，促进欧共体从珠的表面发芽的凝胶上。几天后，无数的船只，可以很容易地相衬和时间推移显微镜下观察。本视频演示了在建立这些文化的关键步骤。

Protocol

制备细胞 M199/10％胎牛血清/笔链球菌（1:100）前1-2天钉珠人脐静脉内皮细胞和成纤维细胞。 开关中EGM – 2（Clonetics）一天HUVEC和一天前珠串成纤维细胞前嵌入。 〜400人脐静脉内皮细胞，每珠浓度是必要的。 20,000元以及成纤维细胞是必要的。 涂层珠与人脐静脉内皮细胞 – 天-1 Trypsinize人脐静脉内皮细胞。 允许珠解决（请勿离心机！?…

Discussion

有越来越多的共识，三维（3D）在体外血管生成的实验提供了一个模型，它在体内更接近实际环境比可达到使用2D文化。很明显，优越的3D系统应重现性好，能够模仿一些血管生成的主要步骤。虽然前几届的3D检测得到了发展，其中许多可以使用难以取得微血管细胞，或仅复述一些阶段。在这个视频中，我们描述和执行在体外血管生成试验，利用人脐静脉EC，这是很容易获得和在血管研究中最常用的EC的优化。该试?…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Cytodex-3 Beads	Reagent	Amersham Pharmacia	17-0485-01	10 g/bottle. 1. 0.5 g of dry beads are hydrated and swollen in 50 mL PBS (pH=7.4) for at least 3 hours at RT. Use a 50 mL tube and place it on the rocker. 2. Let the beads settle down (~ 15 min). Discard the supernatant and wash the beads for a few minutes in fresh PBS (50 mL). 3. Discard the PBS and replace with fresh PBS: 25 mL -> 20 mg/mL => 60000 beads/mL or 50 mL -> 10 mg/mL => 30000 beads/ mL 4. Place the bead suspension in a siliconized glass bottle (Windshield Wiper or Sigmacote). 5. Sterilize the beads by autoclaving for 15 min at 115C. 6. Store it at 4C.
Aprotinin	Reagent	Sigma	A-1153	10mg/bottle. Reconstitute lyophilized aprotinin at 4 U/mL in DI water. Sterile filter. Make aliquots of 1 mL each. Store at -20C.
Fibrinogen Type I	Reagent	Sigma	F-8630	1g. Dissolve 2 mg/mL fibrinogen in DPBS Note clottable protein % and adjust accordingly Heat in a 37C-water bath to dissolve the fibrinogen. Mix by inverting the tube. Do not vortex. Sterile filter through 0.22 um
Thrombin	Reagent	Sigma	T-3399	22 mg=1000 units. Reconstitute in sterile water at 50 U/mL. Make aliquots of 0.5 mL each. Store at -20C.