Angiogenesis 연구에 최적화된 섬유소 젤 비드 분석
Summary
이 동영상은 체외의 angiogenesis 분석에의 프로토콜을 보여줍니다 angiogenesis의 recapitulates 여러 단계의 것을. 시간 저속 돋아의 이미지, 루멘 형성, 분기 및 문합 – angiogenesis의 주요 기능은 – 표시됩니다.
Abstract
Angiogenesis는 angiogenic 자극에 대응, 새로운 선박은 기존 vasculature에서 만들어지는 복잡한 다단계 프로세스입니다. 이러한 단계는 다음과 같습니다 세포외 기질, 코드로 EC의 정렬에 내피 세포의 지하 막, 증식 및 마이 그 레이션 (돋아) (EC)의 저하, 분기, 루멘 형성, 문합, 새로운 지하 막 형성합니다. 시험 관내 assays의 많은이 과정을 연구하기 위해 개발하지만, 대부분의 전용 angiogenesis의 특정 단계를 모방하고, morphologically assays 내에 혈관이 자주 생체내에서 선박과 유사하지되었습니다. Nehls 및 Drenckhahn로 이전 작업을 바탕으로, 우리는 인간 제대 정맥 EC와 섬유아 세포를 이용 체외의 angiogenesis 분석에 최적화했습니다. 이 모델 recapitulates는 angiogenesis의 핵심 초기 단계의 모든하고, 중요한 혈관 편광 EC 둘러싸인 세포 특허 루멘을 표시합니다. EC는 cytodex의 microcarriers에 코팅 및 섬유소 젤에 포함됩니다. 섬유아 세포들은 EC의 구슬의 표면에서 돋아 촉진 필요한 가용성 요소를 제공하는 젤 위에 계층입니다. 며칠 후, 수많은 혈관은 쉽게 위상 대조 및 시간 경과 현미경 하에서 관찰 수있는 선물입니다. 이 동영상이 문화를 설정의 주요 단계를 보여줍니다.
Protocol
Discussion
시험 관내 angiogenesis의 assays에서 (3D) 입체은 2D 문화를 사용하여 얻을 수있는 것보다 생체내의 실제 환경에 훨씬 가까운 모델을 제공 강력히 주장하고있다. 그것은 우수한 3D 시스템은 재현성 수 있으며, angiogenesis의 주요 단계의 몇몇을 모방 수있을 것이 분명합니다. 몇 가지 이전 3D assays가 개발되었습니다 있지만, 이러한 많은도 microvascular 세포를 얻기 위해 열심히 사용, 아니면 단계의 일부를 요점을 되풀이하다….
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cytodex-3 Beads | Reagent | Amersham Pharmacia | 17-0485-01 | 10 g/bottle. 1. 0.5 g of dry beads are hydrated and swollen in 50 mL PBS (pH=7.4) for at least 3 hours at RT. Use a 50 mL tube and place it on the rocker. 2. Let the beads settle down (~ 15 min). Discard the supernatant and wash the beads for a few minutes in fresh PBS (50 mL). 3. Discard the PBS and replace with fresh PBS: 25 mL -> 20 mg/mL => 60000 beads/mL or 50 mL -> 10 mg/mL => 30000 beads/ mL 4. Place the bead suspension in a siliconized glass bottle (Windshield Wiper or Sigmacote). 5. Sterilize the beads by autoclaving for 15 min at 115C. 6. Store it at 4C. |
| Aprotinin | Reagent | Sigma | A-1153 | 10mg/bottle. Reconstitute lyophilized aprotinin at 4 U/mL in DI water. Sterile filter. Make aliquots of 1 mL each. Store at -20C. |
| Fibrinogen Type I | Reagent | Sigma | F-8630 | 1g. Dissolve 2 mg/mL fibrinogen in DPBS Note clottable protein % and adjust accordingly Heat in a 37C-water bath to dissolve the fibrinogen. Mix by inverting the tube. Do not vortex. Sterile filter through 0.22 um |
| Thrombin | Reagent | Sigma | T-3399 | 22 mg=1000 units. Reconstitute in sterile water at 50 U/mL. Make aliquots of 0.5 mL each. Store at -20C. |
References
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro. Histochem Cell Biol. 104, 459-466 (1995).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50, 311-322 (1995).
