Análise imunocitoquímica de células-tronco humanas pluripotentes usando um Self-Made Aparelho Cytospin
Summary
Suspensão coloração imunocitoquímica de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) para marcadores da superfície celular (SSEA-3/SSEA-4) foi alcançada com base na utilização de um aparelho cytospin self-made para criar uma monocamada de células para observação e quantificação.
Abstract
Células pluripotentes estaminais humanas (hPSCs) que incluem células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSCs) são fontes de células emocionante devido à sua ilimitada capacidade de auto-renovação e seu potencial de se diferenciar em vários tipos de células. O estado de pluripotentes hPSCs é tipicamente avaliada por técnicas tais como qPCR, imunocitoquímica, e por outros<em> In vitro</em> E<em> In vivo</em> Estratégias de diferenciação em vários tipos de células. Entre estas, as técnicas de imunocitoquímica têm sido desenvolvidos para a caracterização de rotina do estado indiferenciado de hPSCs com base na análise de biomarcadores candidato intracelulares e de superfície celular. Dado o fato de que hPSCs crescer como colônias, os problemas surgem em quantificar a expressão destes marcadores no nível da célula individual em uma base rotineira. Análises de citometria de fluxo serve para resolver este problema, mas requerem números de celular e uso de reagentes que normalmente não são propícias para a avaliação de rotina de controle de qualidade das culturas hPSC. Assim, o desenvolvimento de meios práticos e reprodutíveis de criação de amostras de células em monocamada com integridade preservada para avaliação marcador tem muitas vantagens nas pesquisas com células-tronco. Este beneficia muito a análise imunocitoquímica porque as células individuais da monocamada podem ser facilmente observados e quantificados para a expressão de marcadores específicos. Para atingir este objetivo, um self-made cytospin aparelho foi construído e otimizado para uso com coloração imuno-histoquímico. Dois marcadores de superfície celular (SSEA3/SSEA4) expressão foram analisados em uma variante da linha de células-tronco BG01 para o objectivo deste protocolo.
Protocol
Discussion
Para efeitos do nosso laboratório, um prato de 35 milímetros de culturas de células-tronco cultivadas em fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) é alocado para o procedimento de coloração imunocitoquímica para uso com o aparelho cytospin. As células são então coletados por meio de passaging enzimática, removendo o máximo da camada de MEF quanto possível, em uma suspensão de uma única célula. Se mais de isolamento de células-tronco eficaz a partir da camada MEF é desejada, as colônias podem ser manua…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiamento parcial para este trabalho foi fornecida pela NSF CARREIRA-0744556 (Rao) e uma bolsa de estudos através do VCU-HHMI Ciências da Educação e Programa de Pesquisa (Pascual).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Lab Tek Permanox Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 117437 | Material for re-used plastic slides | |
| Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned | Fisher Scientific | 12-550-15 | ||
| 0.1-10μL Filter Tips | USA Scientific | 1121-3810 | ||
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 120542-B | ||
| Cytoseal 280 | Richard-Allan Scientific | 8311-4 | Mounting Medium | |
| DPBS | Gibco | 14190 | ||
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 10000C | ||
| Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody | Millipore/Chemicon | MAB4304 | Primary Antibody for SSEA-4 staining | |
| Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody | Millipore/Chemicon | MAB4303 | Primary Antibody for SSEA-3 staining | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen/ Molecular Probes | A11029 | Secondary Antibody for SSEA-4 staining | |
| Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG | Invitrogen/ Molecular Probes | A11006 | Secondary Antibody for SSEA-3 staining | |
| DAPI, Dihydrochloride | CalBioChem | 268298 |
References
- Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. Cell surface markers in human embryonic stem cells. Methods in Mol. Bio. – Stem Cell Assays. 407, 51-61 (2007).
- Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. A homemade cytospin apparatus. Anal. Biochem. 359, 283-284 (2006).
