Иммуноцитохимическая Анализ стволовых клеток человека плюрипотентных использованием Self-Made цитоспина аппарата

Summary

Подвеска иммуноцитохимического окрашивания клеток человека плюрипотентных стволовых (hPSCs) на поверхности клеток маркеры (SSEA-3/SSEA-4) был достигнут на основе использования самодельных цитоспина аппарат для создания монослоя клеток для наблюдения и количественной оценки.

Abstract

Человека плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs), которые включают человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) человека и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) являются захватывающими источников ячейки из-за их безграничную самообновлению возможности и свой потенциал к дифференцировке в различные типы клеток. Плюрипотентных состояние hPSCs, как правило, оцениваются методы, такие как КПЦР, иммуноцитохимия, а также другими<em> В пробирке</em> И<em> В естественных условиях</em> Дифференциацию стратегий на несколько типов клеток. Среди них иммуноцитохимического методы были разработаны для рутинных характеристика недифференцированное состояние hPSCs на основе анализа кандидата внутриклеточной и клеточной поверхности биомаркеров. Учитывая тот факт, что hPSCs растут как колонии, возникают проблемы в количественном выражении эти маркеры на индивидуальном уровне ячейки на регулярной основе. Анализ Проточная цитометрия служить для решения этой проблемы, но требуют числа клеток и использование реагентов, которые обычно не способствуют для рутинной оценки контроля качества HPSC культур. Таким образом, разработка практических и воспроизводимых средствами создания образцы однослойных клетка с сохраненной целостности для оценки маркер имеет много преимуществ в исследования стволовых клеток. Это является серьезным преимуществом для иммуноцитохимического анализ, потому что отдельные клетки монослоя легко можно наблюдать и количественно для выражения специфических маркеров. Для достижения этой цели, самодельные цитоспина аппарат был построен и оптимизирован для использования с иммуноцитохимического окрашивания. Две поверхности клеток маркеры (SSEA3/SSEA4) выражения были проанализированы в стволовые вариант BG01 клеточной линии для целей настоящего Протокола.

Protocol

Часть 1: Подвеска Иммуноцитохимическая Окрашивание Клетки собирают в единое клеточной суспензии. Затем клетки переносят в 1,5-2 мл труб микроцентрифужных и центрифугировали при 200g в течение 4 минут. Клетки омываются аспирационных из супернатанта, ресуспендировали в 1 мл …

Discussion

Для целей нашей лаборатории, 35-мм блюдо из стволовых клеток культур, выращенных на эмбриональных фибробластов мыши (MEFs) выделено на иммуноцитохимического процедуру окрашивания для использования с аппаратом цитоспина. Затем клетки, собранные при помощи ферментативного пассажей, удаля…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Lab Tek Permanox Chamber Slide		Thermo Fisher Scientific	117437	Material for re-used plastic slides
Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned		Fisher Scientific	12-550-15
0.1-10μL Filter Tips		USA Scientific	1121-3810
Microscope Cover Glass		Fisher Scientific	120542-B
Cytoseal 280		Richard-Allan Scientific	8311-4	Mounting Medium
DPBS		Gibco	14190
Normal Goat Serum		Invitrogen	10000C
Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody		Millipore/Chemicon	MAB4304	Primary Antibody for SSEA-4 staining
Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody		Millipore/Chemicon	MAB4303	Primary Antibody for SSEA-3 staining
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG		Invitrogen/ Molecular Probes	A11029	Secondary Antibody for SSEA-4 staining
Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG		Invitrogen/ Molecular Probes	A11006	Secondary Antibody for SSEA-3 staining
DAPI, Dihydrochloride		CalBioChem	268298