Summary
Мы создали мышь модели перивентрикулярной лейкомаляции (ПВЛ), преобладающим травмы головного мозга у недоношенных детей характеризуется перивентрикулярной поражения белого вещества. Гипоксия / ишемии с / без системной инфекции являются основными причинами ПВЛ. Односторонние сонной перевязки и гипоксии экспозиции с / без инъекции липополисахарида создает PVL-подобные повреждения в P6 мышей.
Abstract
Мы опишем протокол для установления мышиных моделях перивентрикулярной лейкомаляции (ПВЛ). ПВЛ является преобладающей формой повреждения мозга у недоношенных детей и наиболее распространенных антецедент церебральным параличом. PVL характеризуется перивентрикулярной белый урон вопрос с видными олигодендроглиальных травмы. Гипоксия / ишемии с или без системной инфекции / воспаление являются основными причинами ПВЛ. Мы используем P6 мыши для создания моделей новорожденных мозговой травмы по индукции гипоксии / ишемии с или без системной инфекции / воспаление с односторонней перевязки сонных последующим воздействием гипоксии с или без введения эндотоксина липополисахарида (ЛПС). Immunohistochemistry по основному белку миелина (ОБМ) или O1 и электронной микроскопии показывают видные потеря миелина в коре головного белого вещества с дополнительной повреждение гиппокампа и таламуса. Создание мышиных моделях ПВЛ значительно облегчит изучение патогенеза заболевания с помощью имеющихся трансгенных линий мышей, проведение испытаний лекарственных препаратов в относительно высокой пропускной образом определить кандидата терапевтических агентов, и испытание трансплантации стволовых клеток с использованием иммунодефицита линий мышей.
Protocol
Подробные процедуры создания новорожденных мозговой травмы в P6 мышей:
- Послеродовая день 6 (Р6) мышей под наркозом с косвенным охлаждением на льду на грани отсутствие реакции на стимуляцию вредных (глубокий наркоз).
- После очистки кожи спиртом, средней линии вентральной разрез делается в передней шеи.
- Под микроскопом рассекает, бифуркации правой общей сонной артерии приближается мягко втягивания omohyoid и кивательной мышц.
- Фасцию вокруг сонной оболочка удаляется, а проксимальный очного отделения изолированы от близлежащих блуждающего нерва и симпатических ганглиев с крючка. Внутренней сонной артерии, то обезболивающий укол использованием прижигание кончика.
- После прижигания, кожный разрез зашивается, и животное остается теплой окончательно проснулся и вернулся к плотине.
- Через час после перевязки, животное помещается в герметичную камеру переплетаются с азотом до уровня 6,0% O 2 не будет достигнут. Животное затем подвергаются до 35 мин гипоксии.
- После гипоксии экспозиции, мыши восстанавливается на грелку (33 ° C) в течение 30 мин, а затем возвращается к плотине. Для создания черепно-мозговая травма с комбинированной гипоксии / ишемии и инфекции / воспаление, животное затем вводили внутрибрюшинно с 0,015 мл липополисахарида (ЛПС, 1 мг / кг).
- Четыре дня post-hypoxia/ischemia, мышей под наркозом с косвенным охлаждением на льду на грани отсутствие реакции на вредные раздражители, то перфузии физиологическим раствором, а затем 4% параформальдегида. Мозги удаляются и cryoprotected.
Рисунок 1. Характеристика травмы головного мозга в гипоксической / ишемической мышиной модели с H & E окрашивания. Существует очаговый некроз (стрелки) в коре головного белого вещества ипсилатеральной () для перевязки сонных, по сравнению с контралатеральной мозговой белом веществе (Б). Ипсилатеральная некроза и координационные микроинфаркты наблюдается в гиппокампе (C) и таламуса (D) в головном мозге с ипсилатеральной мозговой травмы белой материи.
Представитель Результаты и рисунков:
Мышь моделей ПВЛ при гипоксии / ишемии и / или инфекции / воспаления достигается за счет односторонней перевязки сонных последующим воздействием гипоксии и инъекции LPS. Мы определяем новые модели мышей в качестве подходящих моделей ПВЛ. Нейропатологических изучение корональных срезах, окрашенных гематоксилин-и-эозином (H & E) на протяжении всего переднего мозга показывает, очаговый некроз в центральном белом веществе полушария ипсилатерального на сонной перевязки (рис. 1А), с относительно щадящей нейронов в вышележащих коры головного мозга по сравнению с контралатеральной мозговой белого вещества (рис. 1В). В фокальной некротических белого вещества, есть заметное увеличение клеточности, состоящий из макрофагов и реактивные астроциты, как это характерно для человека координационного ПВЛ. В контралатеральной центрального белого вещества, олигодендроглиальных ядер, расположенных в пучковой типа расслоения; эта архитектура полностью нарушена очаговый некроз на ипсилатеральной стороне. Следует отметить, что мы также наблюдаем ипсилатерального некроза в гиппокампе (рис. 1в) и таламуса (фокусное микроинфаркты) (рис. 1D) в головном мозге с ипсилатеральной мозговой травмы белой материи. Человек ПВЛ также не происходит в полной изоляции от сопровождающих серых поражений вопрос. Отличительной чертой ПВЛ является относительной, хотя и не полная, не щадя коры головного мозга вышележащих ранения белое вещество - это функция, которая на наш взгляд, присутствует в нашей модели мыши.
Рисунок 2. Скоринг масштаб для оценки 0-5 белых травмой вопросу MBP или O1 в мышиных моделях перивентрикулярной лейкомаляции.
Наши модели показывают, мыши характеристики ПВЛ как на фенотипические и молекулярном уровнях. Мы использовали иммуноцитохимического обнаружения основному белку миелина (ОБМ) или O1-антигена для оценки повреждений, установили стандартную шкалу от 0 до 5 забить белый травмы вещества (рис. 2), и характеризуется патологии белого вещества (рис. . 3). Совсем недавно, беспристрастной стереологического анализа была выполнена для замены начальной полуколичественного метода. Кроме того, для проверки корреляционного эффектов белого травмы вещества на функциональные результаты, мы провели поведенческие тесты на моторные функции. Мы показали, что мыши выставку поразительный дефицит двигателя на P10-21 гипоксии следующие / ишемии плюс ЛПС на P6. Мы установили забив критерии со шкалой 0-4 для определения дисфункции контралатеральной конечности у мышей ранения на P10-21. Как правило, нормальных мышей может носиться до 30 ° наклон (4 балла) и подняться вверх 45 ° наклон без скольжения (оценка 3). Травмированные мыши имеют более низкие оценки в соотношении с степенями белой травмы вопросе.
Рисунок 3. Характеристика белых травмой вопросу MBP или O1 окрашивания и миелина структуры с помощью электронного микроскопа (EM). MBP и O1 окрашивания показать миелина потере в коре головного белого вещества ипсилатерального для труб, по сравнению с контралатеральной белым веществом. Е. М. рассмотрение показывает, миелинизированных аксонов в белом веществе мозговой контралатеральной для перевязки и выродились ткани в ипсилатеральной белым веществом.
Мы ожидаем, что создание новых моделей мышей ПВЛ позволит нам изучить конкретные механизмы PVL-подобные повреждения незрелый мозг. Мы будем решать вопрос патогенеза использованием трансгенных линий мышей, чтобы изучить роль отдельных молекул интереса и оценить цели нейропротекции.
Discussion
Повреждение развивающегося мозга приводит к разрушительным неврологических последствий. Поразительно, что структура перинатальной травмы головного мозга сильно зависит от возраста. В доношенных детей, это преимущественно поражает кору головного мозга с характерными потерю нейронов. Тем не менее, у недоношенных детей, он избирательно воздействует на мозговой белого вещества с выдающимися травмы развивающимся олигодендроциты, расстройство называется перивентрикулярной лейкомаляции (ПВЛ). Масштабы этой проблемы черепно-мозговой травмы в недоношенного ребенка является экстраординарным. Преждевременные роды и улучшение неонатальной интенсивной терапии привели к почти 90% выживания 13 миллионов недоношенных детей во всем мире (примерно 56 000 в США) родился ежегодно с массой тела до 1500 г, т. е. очень низкой массой тела при рождении. Примерно 10% из оставшихся в живых в дальнейшем проявлять церебральным параличом, и приблизительно 50% из них когнитивных и поведенческих дефицитов. ПВЛ является наиболее важным патологии головного мозга основной церебрального паралича у недоношенных новорожденных. Нет специфической терапии для PVL в настоящее время не существует, отчасти потому, что патогенез не был хорошо понимали 1,2.
Хотя этиология ПВЛ является многофакторной, перинатальная гипоксия / ишемия с материнской внутриутробной инфекции считается основной причиной ПВЛ. Гипоксического / ишемическая модель ПВЛ в крысу на P7 был ранее создан 3. Эта модель уникальна тем, что она напоминает PVL у недоношенных новорожденных. Отличительной чертой данной модели является селективным вопрос белый патологии, в отличие от большинства моделей инсульта, которые характеризуются серые миокарда вопрос. Тем не менее, ограничения гипоксически-ишемической модели у крыс, не следует упускать из виду. Во-первых, этиология ПВЛ часто многофакторная. В дополнение к гипоксии / ишемии, матери и плода инфекции / воспаления тесно связана с ПВЛ. Таким образом, в сочетании гипоксии / ишемии и инфекции / воспаления, скорее всего, создать более PVL-подобных моделей. Грызун возраста, которые наилучшим образом коррелирует с развитием человеческого период наибольшего риска ПВЛ поражений (24-32 недель беременности) является послеродовая потому олигодендроглиальных дифференциация преимущественно послеродовой событием в грызунов. Как невозможно, чтобы произвести матери и плода инфекции / воспаления в постнатальном возрасте, было бы разумно, чтобы имитировать инфекции в соответствующих послеродовой стадии развития, чтобы создать грызуна модель ПВЛ. Мы стремились объединить LPS инъекции гипоксического / ишемической модели у мышей при P6, чтобы произвести больше клинически значимых поражений ПВЛ. Во-вторых, оптимальным доказательством правильности концепции экспериментальный подход к причинным роль молекулы требует использования трансгенных мышей; генетические манипуляции гораздо труднее, у крыс, чем у мыши. Таким образом, мы стремились превратить нашу экспериментальную модель ПВЛ от крысы мыши.
Мышь моделей ПВЛ значительно облегчит 1) изучение биологии и патогенеза заболеваний с использованием имеющихся трансгенных линий мышей, 2) проведение испытаний лекарственных препаратов открыть для себя кандидата препаратов с терапевтическим потенциалом, 3) тестирование утилиты стволовых клеток с использованием штаммов иммунодефицитных мышей.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа частично поддержана грантами от Национального института здоровья (RO1 NS059043 и RO1 ES015988), Национального общества рассеянного склероза, Roche Фонд Анемия исследований, Фельдштейн Медицинский фонд, и Shriners больницы для детей.
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Дэвида Удовольствие за его предложения. Эта работа была частично поддержана грантами для WD из Национального института здоровья (RO1 NS059043 и RO1 ES015988), Национальное общество рассеянного склероза, и Shriners больницы для детей. Мы заявляем, не конкурирующие интересы, связанные с этой статьей.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LPS | Sigma-Aldrich | L4130 | |
| Hypoxia Chamber | BioSpherix | A-30274 | |
| Surgical hook | F.S.T. | 10064-14 |
References
- Volpe, J. J. Neurology of newborn. , Saunders. Philadelphia. 217-276 (2001).
- Deng, W., Pleasure, J., Pleasure, D.
- Follett, P. L., Deng, W., Dai, W., Talos, D. M., Massillon, L. J., Rosenberg, P. A., Volpe, J. J., Jensen, F. E. Glutamate receptor-mediated oligodendrocyte toxicity in periventricular leukomalacia: a protective role for topiramate. J. Neurosci. 24, 4412-4420 (2004).
