Summary
Biz periventriküler lökomalazi (PVL), prematüre bebeklerde periventriküler beyaz cevher lezyonları ile karakterize baskın beyin hasarı fare modelleri kurdu. Hipoksi / iskemi / sistemik enfeksiyon olmadan PVL birincil nedenleri. Tek taraflı karotis ligasyonu ve / lipopolisakkarid enjeksiyon olmadan hipoksi maruz P6 fareler PVL benzeri lezyonlar oluşturur.
Abstract
Biz periventriküler lökomalazi (PVL) fare modelleri kurmak için bir protokol tanımlamaktadır. PVL, beyin hasarı, prematüre bebeklerde serebral palsi en yaygın öncül baskın şeklidir. PVL önde gelen oligodendroglial yaralanması olan periventriküler beyaz cevher hasarı ile karakterizedir. Sistemik enfeksiyon / enflamasyon ya da hipoksi / iskemi PVL birincil nedenleri. P6 fareler iskemi / hipoksi indüksiyon veya maruz kalma ya da hipoksi, endotoksin lipopolisakkarid (LPS) enjeksiyonu olmadan tek taraflı karotis ligasyonu ile sistemik enfeksiyon / iltihap olmadan yenidoğan beyin hasarı modeller yaratmak için kullanın. Miyelin bazik protein (MBP) veya O1 ve elektron mikroskobik inceleme İmmünohistokimya, hipokampus ve talamus ek hasar serebral beyaz cevherde belirgin miyelin kaybı göstermektedir. PVL fare modelleri Kuruluş hastalığının patogenezinde immün yetmezlik fare suşu kullanılarak transgenik fare suşları, ilaç denemelerinin terapötik ajanlar aday belirlemek için nispeten yüksek kapasiteli bir şekilde iletimi, ve kök hücre nakli testi kullanılarak yapılan çalışmada büyük ölçüde kolaylaştıracaktır.
Protocol
P6 farelerde neonatal beyin hasarı oluşturarak detaylı prosedürler:
- Postnatal günde 6 (P6) fareler zararlı stimülasyonu (derin anestezi) yanıtsızlık noktasında buz üzerinde dolaylı soğutma ile anestezi.
- Alkol ile cilt temizliği takiben anterior boyun, karın orta hat kesi yapılır.
- Diseksiyon mikroskobu altında, sağ karotis arter bifurkasyon nazikçe geri çekilmeden omohyoid ve sternokleidomastoid kaslar tarafından yaklaştı.
- Carotica'nın etrafında fasya kaldırılır ve yakındaki bir kanca ile vagus siniri ve sempatik ganglionlar izole proksimal iç dalı. Internal karotid arter sonra dağlama ucunu kullanarak koterize.
- Koterizasyon ardından, cilt insizyonu sütüre edilir ve daha sonra tamamen uyanık ve baraj döndü kadar hayvan sıcak tutulur.
- Ligasyonu Bir saat sonra, hayvan, O 2 ulaşıldığında% 6.0 seviyesine kadar azot ile aşılanmış yalıtılmış bir bölmede yer alır . Hayvan hipoksi 35 dakika sonra maruz kalmaktadır.
- Hipoksiye maruz kaldıktan sonra, farenin 30 dakika için bir ısıtma yastığı (33 ° C) kurtarır ve daha sonra baraj iade edilir. Kombine hipoksi / iskemi ve enfeksiyon / enflamasyon ile beyin hasarı oluşturulması için, hayvanın daha sonra 0.015 ml lipopolisakkarid (LPS, 1 mg / kg) intraperitoneal olarak enjekte edilir.
- Post-hypoxia/ischemia Dört gün sonra sonra tuzlu su ve% 4 paraformaldehid ile perfüze zararlı uyaranlara yanıtsızlık noktasında buz üzerinde dolaylı soğutma, fareler anestezi. Brain kaldırılır ve cryoprotected.
Şekil 1 / hipoksik iskemik fare modelinde H & E boyama ile beyin hasarı Karakterizasyonu. (A) karotis ligasyonu ipsilateral serebral beyaz cevherde fokal nekroz (oklar) kontralateral serebral beyaz madde (B) ile karşılaştırıldığında vardır. Ipsilateral nekroz ve odak microinfarcts hipokampus (C) ve ipsilateral serebral beyaz cevher hasarı ile beyin talamus (D) görülmektedir.
Temsilcisi Sonuçlar ve Şekiller:
Hipoksi / iskemi ve / veya enfeksiyon / enflamasyon PVL fare modelleri, hipoksi ve LPS enjeksiyonu maruz kalma ardından tek taraflı karotis ligasyonu ile elde edilir. Biz yeni fare modelleri uygun PVL model olarak tanımlıyoruz. Nöronların göreceli koruyucu tüm önbeyin üzerinden hematoksilen-eozin (H & E) ile boyandı koronal bölümden nöropatolojik inceleme ile karotis ligasyonu (Şekil 1A) ipsilateral serebral hemisferin merkezi beyaz cevherde fokal nekroz ortaya örten serebral korteksin kontralateral serebral beyaz cevher (Şekil 1B). Fokal nekrotik beyaz cevher, odak insan PVL karakteristik olarak makrofaj ve reaktif astrositler hücresellik oluşan artış var işaretlenir. Kontralateral merkezi beyaz cevher, oligodendroglial çekirdekleri fasiküler gibi demetleri düzenlenmiş; bu mimari, ipsilateral tarafta fokal nekroz tamamen bozulur. Unutmayın ki, biz de ipsilateral serebral beyaz cevher hasarı ile beyinlerinde ipsilateral hipokampus nekroz (Şekil 1C) ve talamus (odak microinfarcts) (Şekil 1D) gözlemlemek. İnsan PVL da gri madde lezyonları ile birlikte komple izolasyon oluşmaz. Fare modellerinde mevcut olduğunu düşündüğünüz bir özelliği - PVK işaretidir yaralı beyaz cevher örten serebral korteksin koruyucu, tam akrabası, olmasa da.
Şekil 2 MBP veya O1 periventriküler lökomalazi fare modellerinde beyaz cevher hasarı değerlendirmek için 0-5 Puanlama ölçekli.
Bizim fare modelleri, fenotipik ve moleküler düzeyde hem de PVL özellikleri göstermektedir. Biz miyelin bazik protein (MBP) veya A1-antijen immünositokimyasal algılama, yaralanma değerlendirmek için kullanmışlardır beyaz cevher hasarı (Şekil 2) puan, 0 ila 5 standart bir ölçek kurduk ve beyaz cevher patolojisi (Şekil karakterize var 3). Daha yakın zamanlarda, önyargılı olmayan bir stereolojik tahlil, ilk yarı-kantitatif bir yöntem yerine uygulamaya konmuştur. Buna ek olarak, fonksiyonel sonuçlar üzerine beyaz cevher hasarı bağıntılı etkileri test etmek için, motor fonksiyon için davranışsal testler gerçekleştirdik. Biz farelerin P6 az aşağıdaki P10-21 hipoksi / iskemi artı LPS çarpıcı motor defisiti sergilediklerini göstermiştir. P10 yaralı farelerde kontrlateral ekstremite fonksiyon bozukluğu tanımlamak için bir ölçekte 0-4 puanlama kriterleri kurduk-21. Tipik olarak, 30 ° eğim (4 puan) normal fareler kadar koşar ve 45 kadar tırmanmaya ° sürgülü olmadan eğim (3 puan). Yaralı fareler beyaz cevher hasarı derecesi ile korelasyon daha düşük puanlar var.
Şekil 3 MBP veya O1 boyama ve miyelin yapısı elektron mikroskobu (EM) ile beyaz cevher hasarı Karakterizasyonu. MBP ve kontralateral beyaz maddeye göre ligasyonu ipsilateral serebral beyaz cevher O1 boyama gösterisi miyelin kaybı,. EM muayene ligasyonu kontralateral serebral beyaz cevher miyelinli aksonlar gösterir ve ipsilateral beyaz cevher doku dejenere.
Biz PVL yeni fare modelleri kurulması PVL gibi yaralanma özel mekanizmalar bize immatür beyin çalışma izin olacağını tahmin ediyoruz. Biz bireysel ilgi moleküllerin rolünü incelemek ve nöro hedefleri değerlendirmek için transgenik fare suşu kullanılarak patogenezinde ele alınacaktır.
Discussion
Gelişmekte olan beyin yaralanması, yıkıcı nörolojik sonuçlara yol açar. Çarpıcı, perinatal beyin hasarı desen yüksek oranda yaşa bağlıdır. Term bebeklerde, ağırlıklı olarak, karakteristik nöron kaybı ile serebral korteks etkiler. Ancak, prematüre bebeklerde, seçici, gelişmekte olan oligodendrosit önde gelen yaralanma ile serebral beyaz cevher etkiler periventriküler lökomalazi (PVL) olarak adlandırılan bir hastalık. Prematüre bebekte beyin hasarı sorunun büyüklüğü olağanüstü. Erken doğum ve gelişmiş yenidoğan yoğun bakım yıllık bir doğum ağırlığı 1500 gr altında, yani çok düşük doğum ağırlıklı bebeklerde doğmuş dünya çapında 13 milyon prematüre bebeklerde (Amerika Birleşik Devletleri yaklaşık 56.000) yaklaşık% 90 hayatta kalma yol açmıştır. Kurtulanların yaklaşık% 10 daha sonra serebral palsi sergiler ve yaklaşık% 50 oranında bilişsel ve davranışsal eksiklikler var. PVL prematüre bebeklerde en önemli beyin altta yatan patolojinin serebral palsi. Patogenezinde 1,2 iyi anlaşılmaktadır değil, çünkü PVL için spesifik bir tedavisi yok şu anda kısmen var.
PVL, etyolojisi multifaktöriyel olmasına rağmen, anne rahim içi enfeksiyonu olan perinatal hipoksi / iskemi PVL bir birincil nedeni olduğu düşünülmektedir. P7 sıçan PVL / A hipoksik iskemik modeli daha önce 3 kurulmuştur. Bu model, prematüre bebeklerde PVL benzediği eşsizdir. Bu modelin en belirgin özelliği, gri cevherde enfarktüsü ile karakterize olan inme modelleri çoğunluğunun aksine, seçici beyaz madde patolojisi. Ancak, sıçanlarda hipoksik-iskemik model sınırlamaları göz ardı edilmemelidir. Öncelikle, PVL etiyolojisinde genellikle multifaktöryel. Hipoksi / iskemi, maternal-fetal enfeksiyon / inflamasyona ek olarak güçlü bir PVL ile ilişkilidir. Böylece, kombine hipoksi / iskemi ve enfeksiyon / enflamasyon büyük olasılıkla daha PVL gibi modeller oluşturmak. Oligodendroglial farklılaşma, ağırlıklı olarak bir doğum sonrası olay kemirgenler, çünkü en iyi PVL lezyonlar (gebeliğin 24-32 hafta) için en büyük risk, insan gelişim dönemi ile ilişkilidir kemirgen yaş postnatal. Doğum sonrası yaşlarda anne-fetal enfeksiyon / iltihap üretmek olanaksız olduğundan, PVL bir kemirgen modeli oluşturmak için ilgili bir postnatal gelişim aşamasında bir enfeksiyon simüle etmek mantıklı olacaktır. Biz klinik olarak daha anlamlı PVL lezyonlar üretmek için, LPS enjeksiyonu P6 az farelerde / hipoksik iskemik modeli ile birleştirmek için çalışmışlardır. İkincisi, bir molekülün etken bir rol için en uygun proof-of-concept deneysel yaklaşım, transgenik farelerin kullanımı gerektirmektedir; genetik manipülasyonlar sıçan fare göre çok daha zor. Böylece, sıçan, fare PVL bizim deneysel model dönüştürmek için çalışmışlardır.
2) tedavi potansiyel aday ajanları keşfetmek için ilaç denemelerinin iletimi; 3) immünyetmezligi fare suşu kullanılarak kök hücre yardımcı programı test PVL Fare modelleri 1) transgenik fare suşu kullanılarak hastalığın biyolojisi ve patogenezi çalışma büyük ölçüde kolaylaştıracaktır.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (RO1 NS059043 ve RO1 ES015988), Ulusal Multipl Skleroz Derneği, Anemi Araştırma, Feldstein Tıp Vakfı Roche Vakfı ve Çocuk Hastaneleri Shriners hibe tarafından desteklenen parçası.
Biz onun önerileri için Dr David Pleasure teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma kısmen, Ulusal Sağlık Enstitüleri WD hibeler (RO1 NS059043 ve RO1 ES015988), Ulusal Multipl Skleroz Derneği, Çocuklar için Shriners Hastaneler tarafından desteklenmiştir. Biz bu makalede ilgili hiçbir çatışan çıkarları beyan ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LPS | Sigma-Aldrich | L4130 | |
| Hypoxia Chamber | BioSpherix | A-30274 | |
| Surgical hook | F.S.T. | 10064-14 |
References
- Volpe, J. J. Neurology of newborn. , Saunders. Philadelphia. 217-276 (2001).
- Deng, W., Pleasure, J., Pleasure, D.
- Follett, P. L., Deng, W., Dai, W., Talos, D. M., Massillon, L. J., Rosenberg, P. A., Volpe, J. J., Jensen, F. E. Glutamate receptor-mediated oligodendrocyte toxicity in periventricular leukomalacia: a protective role for topiramate. J. Neurosci. 24, 4412-4420 (2004).
