Bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC) Dosage pour les interactions protéine-protéine dans les cellules d'oignon Utilisation du pistolet à gènes Helios
Summary
Cet article illustre comment utiliser correctement l'Helios BioRad Gene Gun pour introduire l'ADN plasmidique dans les cellules de l'épiderme et l'oignon comment tester interactions protéine-protéine dans les cellules de l'oignon basé sur le principe de complémentation par fluorescence bimoléculaire (BiFC)
Abstract
Enquête sur la fonction des gènes dans des organismes variés s'appuie sur la connaissance de la façon dont les produits des gènes interagissent les uns avec les autres dans leur environnement cellulaire normal. La complémentation bimoléculaire fluorescence (BiFC) Assay<sup> 1</sup> Permet aux chercheurs de visualiser les interactions entre protéines dans les cellules vivantes et est devenu un outil de recherche indispensable. Ce dosage est basé sur l'association facilitée de deux fragments d'une protéine fluorescente (GFP) qui sont chacun fusionné à une protéine interagissant partenaires potentiels. L'interaction des deux protéines partenaires serait de faciliter l'association de la N-terminal et fragment C-terminal de la GFP, conduisant à la fluorescence. Pour les chercheurs cellules végétales, oignons épidermiques sont un système idéal d'expérimentation pour la réalisation du dosage BiFC raison de la facilité à obtenir et à préparer les tissus oignon et la visualisation directe de la fluorescence avec la fluorescence de fond minimal. Le pistolet à gènes Helios (BioRad) est couramment utilisé pour bombarder l'ADN plasmidique dans les cellules d'oignon. Nous démontrons l'utilisation d'Hélios pistolet à gènes à introduire constructions plasmidiques pour deux interagissant<em> Arabidopsis thaliana</emFacteurs de transcription>, Seuss (UFE) et HOMOLOGUE LEUNIG (LUH)<sup> 2</sup> Et la visualisation de leurs interactions médiées par les cellules d'oignon BiFC épidermique.
Protocol
Discussion
- Pour les utilisateurs de première fois, nous vous recommandons de pratiquer toute la procédure, de la préparation Cartouche d'observation, avec un seul reporter constitutive plasmide tel que 35S:: GFP ou 35S:: GUS. Nous avons utilisé un 35S:: plasmide GFP obtenu de MM. Steve Mount et Zhang Xiaoning 6 (figure 1A, D). Les cartouches gène tiré de contrôle vendus à RioRad (Cat 165-2244) ne sont pas appropriées pour les plantes.
- Pour BiFC, un deuxième contrôle positif est nécessaire, ce qui devrait se co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les Drs. Steve Mount et Zhang Xiaoning pour le 35S:: GFP pGlowbug construire et l'Hokensen Bourse de doctorat au CH de recherche dans le laboratoire de Z. L's est soutenue par le US National Science Foundation (IOB0616096 et MCB0744752). ZL est partiellement pris en charge par l'Université du Maryland de la station expérimentale agricole.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Yellow onion | Any supermarket | |||
| Helios Gene Gun | BioRad | |||
| Fluorescent microscope with appropriate filters for GFP or YFP | Zeiss, Nikon, Olympus |
References
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