双分子荧光互补（附设）检测蛋白质相互作用的洋葱细胞使用的Helios基因枪
Summary
本文介绍了如何正确使用BioRad公司赫利奥斯基因枪引入洋葱表皮细胞的质粒DNA，以及如何测试基于双分子荧光互补的原则（附设）洋葱细胞中的蛋白质 – 蛋白质相互作用
Abstract
在不同生物体的基因功能的研究依赖于基因产物如何彼此互动在正常的细胞环境的知识。双分子荧光互补（附设）含量<sup> 1</sup>，使研究人员能够可视化在活细胞内蛋白质相互作用，并已成为一个重要的研究工具。此法是基于两个片段的一种荧光蛋白（GFP）的，每一个融合到一个潜在的相互作用蛋白伙伴促进协会。两个蛋白合作伙伴的互动，将有利于协会的N端和C -末端片段的GFP，导致荧光。对于植物的研究人员，洋葱表皮细胞是一种理想的实验系统进行，因为在获得和准备洋葱组织的易用性和最小的背景荧光的荧光直接可视化的附设实验。赫利奥斯基因枪（BioRad公司）是常用的轰击洋葱细胞的质粒DNA。我们证明使用赫利俄斯基因枪引入两个相互作用的质粒结构<em>拟南芥</em>转录因子，苏斯（SEU）和LEUNIG同源（LUH）<sup> 2</sup>和它们之间的相互作用附设在洋葱表皮细胞介导的可视化。
Protocol
一，质粒制备轰击使用的质粒DNA必须是高纯度和浓度500ng/μl或更大。附设涉及两个质粒结构，需要25微克的每个质粒。换句话说，两个质粒的1:1摩尔比混合，给墨盒准备上升到50微克质粒DNA总量。要留意超过50微克，增加更多的DNA可能会导致金颗粒的集聚，并应避免。市售的质粒DNA提取试剂盒隔离质粒DNA的建议。 质粒载体应在pUC19中，如规模相对较小。?…
Discussion
- 对于首次用户，我们建议实行整个过程，从墨盒准备观察，用一个单一的质粒构记者如35S：：GFP或35S：：GUS。我们使用了35S：：GFP质粒从博士获得。史蒂夫山和小宁张6（图1A，D）。不适合植物基因出手控制RioRad（猫165-2244）出售的墨盒。
- 对于附设，第二个阳性对照是必要的，应当由两个已知的交互融合YFP的C端和N -末端片段的合作伙伴，分别。
- 对于附设，这是必要的，包括一些负面控制…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢博士。史蒂夫和晓宁张山的35S：：GFP pGlowbug构造的Hokensen Z。欧莱雅的实验室研究到CH的博士后研究是由美国国家科学基金会（IOB0616096和MCB0744752）支持。 ZL是由美国马里兰大学农业试验站的部分支持。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Yellow onion | Any supermarket | |||
| Helios Gene Gun | BioRad | |||
| Fluorescent microscope with appropriate filters for GFP or YFP | Zeiss, Nikon, Olympus |
References
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9 (4), 789-789 (2002).
- Sitaraman, J., Bui, M., Liu, Z. LEUNIG_HOMOLOG and LEUNIG perform partially redundant functions during Arabidopsis embryo and floral development. Plant Physiol. 147 (2), 672-672 (2008).
- Walter, M. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant J. 40 (3), 428-428 (2004).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
- Azhakanandam, S., Nole-Wilson, S., Bao, F., Franks, R. G. SEUSS and AINTEGUMENTA mediate patterning and ovule initiation during gynoecium medial domain development. Plant Physiol. 146 (3), 1165-1165 (2008).
- Zhang, X. N., Mount, S. M. Two alternatively spliced isoforms of the Arabidopsis SR45 protein have distinct roles during normal plant development. Plant Physiol. 150 (3), 1450-1450 (2009).
Cite This Article
Hollender, C. A., Liu, Z. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun. J. Vis. Exp. (40), e1963, doi:10.3791/1963 (2010).