Overview
이 비디오는 그들의 잠복 및 터널링 능력을 평가해서 Drosophila 애벌레에 있는 저산소증을 시험하는 방법을 보여줍니다. 이 기술을 사용하여 연구원은 발달 적자를 가진 사람들에서 산소 부족을 경험하는 애벌레를 구별할 수 있습니다. 예제 프로토콜은 이 분석기의 설정을 보여 줍니다.
Protocol
이 프로토콜은 Drosophila 멜라노가스터 애벌레, J. Vis. Exp. (2018)에서 저산소증 검출을 위한 잠복/터널링 분석에서 발췌한 것입니다.
1. 애벌레의 준비
- 분석을 시작하기 2 일 이상 전에, Wieschaus와 Nusslein-Volhard에 의해 설명된 대로 계란 평신기 요리에 원하는 실험 및 제어 조합 (최소 20 암컷 과 10 수컷)의 십자가를 설정하지만 50 mL 폴리 프로필렌 비커와 포도가 함유 된 6.0cm 일회용 페트리 접시를 사용 하 여 사용 하기 전에. 필요할 때까지 실온에서 어둠 속에서 달걀 평신도 요리에 파리를 유지하십시오.
- 포도 가루 레시피 – 100mL 냉동 100% 포도 주스 농축액, 350mL 탈오이오이니드 워터, 5mL 빙하 아세트, 13 g D. 멜라노가스터 한가르를 1L 유리 비커에 넣습니다. 1-2분 만에 전자레인지에 전자레인지를 돌리며, 한천이 모두 녹을 때까지 버스트 사이를 저어줍니다. 몇 분 동안 용액을 식힌 다음 95 % 에탄올에 니페이젠 (메틸-p -하이드록시 벤조아테)의 10 % (w / v)의 10 mL을 추가합니다. 혼합한 다음 플레이트당 7mL를 일회용 6.0cm 페트리 접시에 넣고 실온에서 3-4h의 젤과 건조를 허용합니다. 비닐 봉지에 4 °C에 보관하십시오.
- 효모 페이스트 레시피 – 말린 효모 7g, 10mL 탈온수, 균일한 일관성까지 주걱과 섞는다.
- 실험및 제어 애벌레를 생성하는 시간 조정 계란 컬렉션. 새로운 효모 얼룩, 포도 접시를 사용하여, 아침 시간 동안 어둠 속에서 4 시간 동안 실온에서 계란을 수집합니다. 이 4h 컬렉션 플레이트를 제거하고 신선한 접시로 교체하십시오. 애벌레의 대부분이 부화 될 때, 다음 날 오후까지 25 °C에서 하룻밤 4 h 수집 플레이트를 배양한다. 이 첫 번째 인스타 애벌레를 수집하고 실험을 설정하는 데 사용합니다.
2. 분석 플레이트 설정
- 분석 플레이트의 준비. 분석의 단일 실행을 위해, 각각 10 개의 실험 애벌레와 10 개의 제어 애벌레의 5 플레이트 각각 5 개의 분석 플레이트를 준비하십시오. 1.5cm 코르크 보어를 사용하여 각 접시에서 한천의 중앙 코어를 제거하여 음식에 구멍이 생드려보도록 합니다. 효모 페이스트(0.8~0.9g)를 구멍에 넣고 주걱으로 부드럽게 두드려 마운드가 홀을 채우는 것을 합니다.
- 한천 플레이트 준비 – 700mL 의 질산화물과 16g D. 멜라노가스터 식재료를 2L 유리 비커에 넣고 전자레인지를 5분간 결합합니다. 전자레인지에서 꺼내 유리 막대로 저어서 녹지 않은 한천을 용액에 넣습니다. 17.5mL의 10% (w/v) Nipagen을 95%에 탄올에 넣고 섞은 다음 30s 버스트에서 전자레인지 가열을 계속한 다음 모든 한천이 완전히 용해될 때까지 저어줍니다. 1~2분 간 식힌 다음 파이펫 15mL 알리코를 10cm 플라스틱 페트리 접시에 넣습니다. 한천을 젤로 만들고 뚜껑이 있는 접시를 덮고 실온에서 몇 시간 또는 하룻밤 동안 건조시키십시오. 18°C에서 밀봉된 비닐 봉지에 접시를 보관하십시오.
참고 1: 과도한 탈충으로 인해 플레이트 표면에 Nipagen 결정의 형성을 피하려면 준비 며칠 이내에 플레이트를 사용하십시오. 필요한 경우 95%의 알코올을 적어 몇 마이크로리터를 떨어뜨려 결정을 다시 용해시킬 수 있습니다.
참고 2: 한천의 배치는 다른 겔화 특성을 가질 수 있습니다. 마른 젤 플레이트는 코르크 보어를 사용하여 식품 구멍을 만들 때 깨끗하고 그대로 된 천원을 제거 할 수 있다는 터치에 단단하고 충분히 탄력적이어야합니다 (위 참조). - 분석 접시에 애벌레를 설정합니다. 기계적 압력을 사용하여 플라스틱 마이크로스파툴라의 끝을 구부리고 효모 페이스트에 팁을 찍어 애벌레를 따기위한 "접착제"를 제공합니다. 첫 번째 별 애벌레를 개별적으로 집어 들고 음식 마운드 근처의 한천 접시에 놓습니다. 실험 및 제어 유전자형을 위해 10개의 애벌레의 적어도 5개의 복제 판을 준비하십시오. 완료되면 각 플레이트를 캡및 라벨로 표시하고 실온에서 어두운 공간에 플레이트(뚜껑 면)를 설정합니다(실험실에서는 22°C).
3. 분석 플레이트 모니터링
- 해부 현미경으로 매일 접시를 검사하고 음식 의 상단 또는 천 표면에 애벌레의 수를 기록합니다. 눈에 보이는 죽은 유충이나 죽어가는 애벌레에 유충을 유의하십시오. 애벌레가 세 번째 인스타로 이동함에 따라 한천 지하층으로 터널링하는 경우, 그리고 경우에 유충이 보입니다. 푸파가 형성하기 시작하고 어떤 pupal 이상을 주의하기 시작하는 날짜를 참고하십시오. 모든 애벌레가 죽거나 새끼를 당기때까지 매일 관찰을 계속하십시오.
- 구부러진 놀리는 바늘로 접시에서 조심스럽게 강아지를 제거하고 포도 판으로 옮습니다. 원하는 경우, 성인으로 가까운 얼마나 많은 결정하기 위해 강아지를 모니터링 계속합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Dehydrated yeast | |||
| Frozen grape juice concentrate | Welch's | Available at most large supermarkets | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Drosophila agar | Apex Bioresearch Products | 66-103 | |
| Methyl-para-hydroxybenzoate | Apex Bioresearch Products | 20-658 | |
| EQUIPMENT | |||
| 50 ml polypropylene beakers | |||
| 6.0 cm disposable Petri dishes | Falcon | 08757100B | |
| 10 cm disposable plastic Petri dishes | E+K Scientific | EK-24104 | |
| Plastic microspatulas | Corning Incorporated | 3012 | |
| Bent teasing needle | Nasco | S08848MH | |
| Dissecting microscope | Any microscope with 10-30X magnification |
