Summary
Este protocolo describe la aplicación de la terapia fotodinámica antimicrobiana (aPDT) en un modelo murino de candidiasis oral. La aPDT se realizó utilizando una mezcla soluble en agua de curcuminoides y luz LED azul.
Abstract
La terapia fotodinámica antimicrobiana (aPDT) se ha investigado ampliamente in vitro, y los modelos animales preclínicos de infecciones son adecuados para evaluar tratamientos alternativos antes de los ensayos clínicos. Este estudio describe la eficacia de la aPDT en un modelo murino de candidiasis oral. Cuarenta ratones fueron inmunosuprimidos con inyecciones subcutáneas de prednisolona, y sus lenguas fueron inoculadas utilizando un hisopo oral previamente empapado en una suspensión celular de C. albicans . La tetraciclina se administró a través del agua potable durante el transcurso del experimento. Cinco días después de la inoculación fúngica, los ratones se distribuyeron aleatoriamente en ocho grupos; Un noveno grupo de ratones no infectados no tratados se incluyó como control negativo (n = 5). Se probaron tres concentraciones (20 μM, 40 μM y 80 μM) de una mezcla de curcuminoides con una luz LED azul (89,2 mW/cm2; ~455 nm) y sin luz (grupos C+L+ y C+L-, respectivamente). Se evaluaron como controles la luz sola (C-L+), ningún tratamiento (C-L-) y los animales sin infección. Los datos se analizaron mediante ANOVA de Welch y pruebas de Games-Howell (α = 0,05). La candidiasis oral se estableció en todos los animales infectados y se visualizó macroscópicamente a través de la presencia de manchas blancas características o pseudomembranas en el dorso de las lenguas. Los cortes histopatológicos confirmaron una gran presencia de levaduras y filamentos limitados a la capa queratinizada del epitelio en el grupo C-L-, y la presencia de células fúngicas disminuyó visualmente en las imágenes obtenidas de ratones sometidos a aPDT con curcuminoides de 40 μM u 80 μM. La aPDT mediada por 80 μM de curcuminoides promovió una reducción de 2,47 log10 en el recuento de colonias en comparación con las del grupo C-L- (p = 0,008). Todos los demás grupos no mostraron una reducción estadísticamente significativa en el número de colonias, incluidos los grupos fotosensibilizadores (C+L-) o los grupos de luz sola (C-L+). La aPDT mediada por curcuminoides redujo la carga fúngica de las lenguas de los ratones.
Introduction
La candidiasis oral (OC) es la principal infección fúngica de la cavidad oral; es causada por el crecimiento excesivo de Candida spp. Los factores predisponentes para el CO incluyen la disfunción endocrina, el uso de antibióticos de amplio espectro, la radioquimioterapia y la quimioterapia, las deficiencias nutricionales, la xerostomía (bajo flujo salival), el uso de dentaduras postizas, la mala higiene y, especialmente, la inmunosupresión1. Entre las especies de Candida, Candida albicans es la más prevalente y virulenta; Se encuentra como especie comensal en el cuerpo humano y como patógeno oportunista. C. albicans tiene la capacidad de cambiar su morfología de levaduras comensales (blastóforos) a filamentos patógenos (hifas y pseudohifas)2. Las formas filamentosas, especialmente las hifas, pueden invadir el epitelio del huésped por endocitosis o penetración activa, causando infección3. Otros factores de virulencia de C. albicans incluyen la adhesión, la formación de biopelículas y la secreción de enzimas y toxinas lipolíticas e hidrolíticas, como lipasas, fosfolipasas, proteinasas y candidalisina4.
Los tratamientos antifúngicos implican el uso de agentes antifúngicos, especialmente polienos y azoles tópicos (nistatina y miconazol)5. Sin embargo, solo muestran eficacia a corto plazo y la recurrencia es frecuente. Además, el uso excesivo de antifúngicos ha dado lugar al problema del desarrollo y la propagación de la resistencia a los antifúngicos6. Por lo tanto, se necesitan terapias alternativas, como la terapia fotodinámica antimicrobiana (aPDT), que combina un fotosensibilizador (PS) y luz a una longitud de onda adecuada (la misma que la de la absorción de PS) en presencia de oxígeno. Las PS se unen a las células o son absorbidas por ellas y, cuando son activadas por la luz, producen especies reactivas de oxígeno (ROS) que son tóxicas para las células sensibilizadas7.
En la aPDT, uno de los fotosensibilizadores (PS) empleados es la curcumina (CUR), un compuesto natural extraído de los rizomas de la planta de cúrcuma (Curcuma longa L.). La curcumina posee numerosos atributos terapéuticos, incluyendo capacidades antiinflamatorias, antioxidantes, anticancerígenas y antimicrobianas 8,9. Una investigación previa encontró que la aPDT que utiliza CUR disminuyó efectivamente C. albicans en un modelo murino de candidiasis oral sin causar ningún daño a los tejidos del huésped10. El CUR es el principal curcuminoide extraído de la cúrcuma, pero otros polifenoles, como la demetoxicurcumina y la bis-demetoxicurcumina, también se encuentran en esta planta. La aPDT mediada por curcuminoides demostró actividad antibacteriana contra biopelículas de Staphylococcus aureus cultivadas en catéteres11. Sin embargo, hasta donde sabemos, su actividad antifúngica contra C. albicans sigue sin estar clara. Por lo tanto, en este estudio, evaluamos la aPDT mediada por una sal curcuminoide contra C. albicans en un modelo murino de CO.
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Protocol
El protocolo de investigación para el uso de ratones fue aprobado por el Comité de Ética para el Uso de Animales (casos números 05/2008 y 09/2020) de la Facultad de Odontología de Araraquara, UNESP. Se utilizó C. albicans (ATCC 90028) como cepa de referencia. Para el presente estudio se utilizaron ratones suizos hembra de seis semanas de edad (n = 45), con un rango de masa corporal de 20-30 g. Los animales fueron proporcionados por la Universidad Estadual Paulista, UNESP, Botucatu.
1. Preparación de PS y selección de la fuente de luz para aPDT
- Prepare el PS de acuerdo con las especificaciones de la sustancia que se va a probar.
NOTA: En este estudio, se utilizó una mezcla soluble en agua de curcuminoides (mezcla de sales solubles en agua a base de CUR12) como PS (ver Tabla de Materiales y Figura 1). Las diluciones a 20 μM, 40 μM y 80 μM (15,6, 29,2 y 58,4 mg/L, respectivamente) se prepararon en agua ultrapura inmediatamente antes de su uso y se mantuvieron a 5 °C. - Seleccione un equipo de luz con una longitud de onda adecuada (la misma que la de la absorción PS) capaz de iluminar todo el objetivo fotosensibilizado de manera uniforme y simultánea sin calentar el tejido.
NOTA: En este estudio, se utilizó una pieza de mano que contenía un diodo emisor de luz (LED, ver Tabla de Materiales), que fue diseñada en el Instituto de Física de São Carlos (Universidad de São Paulo, São Carlos, SP, Brasil). La potencia de salida entregada por la luz fue de 89,2 mW/cm2 a una longitud de onda azul de aproximadamente 455 nm.
2. Preparación del inóculo de C. albicans
- Mantener la cepa de referencia C. albicans (ATCC 90028) en levadura-peptona-glucosa (YEPD, ver Tabla de Materiales) con glicerol al 50% a -80 °C hasta su uso.
- Descongelar la cepa congelada a temperatura ambiente, extender una alícuota de 100 μL en una placa de Petri con agar dextrosa Sabouraud (SDA) con cloranfenicol (ver Tabla de Materiales), e incubar a 37 °C durante 48 h.
- Transfiera cinco colonias a 10 mL de caldo de nitrógeno de levadura con medio de glucosa al 2% (YNBg) y crezca aeróbicamente a 37 °C durante 16 h.
- Diluir el cultivo de levadura en YNBg fresco (1:10) e incubar aeróbicamente a 37 °C hasta que la densidad óptica alcance la fase logarítmica media de crecimiento.
NOTA: Estandarizar previamente la curva de crecimiento microbiano para cada laboratorio. En la presente investigación, los cultivos se dejaron incubar durante unas 8 h, hasta que alcanzaron la fase logarítmica media de crecimiento, como indica la densidad óptica a 540 nm (OD540), con un valor medio de 0,536 ± 0,062 unidades arbitrarias (media ± desviación estándar [DE]). - Centrifugar el cultivo a 5.000 x g a temperatura ambiente durante 5 min, desechar el sobrenadante y lavar el gránulo dos veces con el mismo volumen de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS; 0,136 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 10 mM Na2HPO4, pH 7,4).
- Utilice alícuotas de 100 μL para realizar cuatro diluciones seriadas de 10 veces en PBS, extienda las diluciones en placas SDA e incube a 37 °C durante 48 h para el recuento de colonias. Como estándar, las suspensiones fúngicas se utilizan en concentraciones de aproximadamente 4,5 × 107 unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/mL)].
3. Inducción de CO en ratones
NOTA: La siguiente metodología fue descrita previamente por Takakura et al.13 y reproducida por nuestro grupo10,14, con algunas modificaciones.
- Distribuya aleatoriamente los ratones en nueve grupos (n = 5), correspondientes al mismo número de tratamientos (Ficha Suplementaria 1).
NOTA: La cavidad oral de los ratones debe ser negativa para el crecimiento de Candida . Esto debe comprobarse frotando la cavidad bucal con un hisopo y colocando la muestra en SDA. - Mantener a los animales en cajas de propileno10 (5 ratones por caja como máximo), con virutas de madera para cubrir el suelo, en un vivero a temperatura controlada a 23 ± 2 °C bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 h. No es necesario proporcionar ningún enriquecimiento específico.
- Mantenga a los ratones con dieta extruida para ratones y agua filtrada ad libitum.
- Inyectar por vía subcutánea el fármaco inmunosupresor prednisolona (100 mg/kg de peso corporal, ver Tabla de Materiales), por primera vez el primer día a todos los miembros de los grupos C+L+ 20, C+L+40, C+L+80, C+L- 20 μM, C+L- 40, C+L- 80, C-L+ y C-L- (Ficha complementaria 1).
NOTA: Mantenga a los ratones del mismo grupo en la misma caja y vigílelos diariamente para detectar cualquier signo de estrés y pérdida de peso. Busque consejo veterinario para analgésicos o alimentos / agua alterados si se nota estrés o pérdida de peso. - A partir del primer día y hasta el final del experimento, suministre clorhidrato de tetraciclina en el agua potable a 0,83 mg/mL13.
- Inocular lenguas de ratones en el segundo día, incluidos los grupos C+L+ 20, C+L+40, C+L+80, C+L-20, C+L-40, C+L-80, C-L+ y C-L- (Archivo suplementario 1), con el inóculo de C. albicans . No inocule a los ratones del grupo de control negativo (NCtrl).
- Sedar a los animales mediante inyección intramuscular de cloruro de clorpromazina (ver Tabla de materiales) en cada músculo del muslo antes de llevar a cabo la inoculación.
- Realizar la inoculación intraoral de los ratones sumergiendo un hisopo estéril (uno por animal) en una suspensión estandarizada de C. albicans recién preparada (es decir, preparada inmediatamente antes de la inoculación).
- Coloque a los ratones sedados en posición supina. Saca suavemente la lengua de la boca con una pinza estéril. Frote la lengua de cada ratón con un hisopo empapado durante 30 segundos. Vigile a los ratones hasta que se recuperen de la sedación.
- Al quinto día, administrar una inyección subcutánea complementaria de prednisolona (100 mg/kg de peso corporal) para mantener la inmunosupresión.
NOTA: Este protocolo es adecuado para mantener la infección durante 7 días después de la inoculación intraoral. La escala de tiempo del protocolo se muestra en la Figura 2.
4. Terapia fotodinámica antimicrobiana y recuperación de C. albicans de lesiones orales
- En el séptimo día, antes del tratamiento, anestesiar a los animales mediante una inyección intraperitoneal de clorhidrato de ketamina (100 mg/kg de peso corporal) combinada con xilacina (10 mg/kg de peso corporal) (ver Tabla de Materiales).
- Coloque a cada animal en posición supina sobre un dispositivo de almohadilla14,15 equipado con alambres de acero inoxidable que se pueden enrollar alrededor de los incisivos para mantener la boca abierta.
NOTA: Se recomiendan almohadillas isotérmicas para calentar a los ratones mientras están sedados, previniendo la hipotermia a temperatura ambiente y evitando la mortalidad relacionada con la anestesia15. Cada animal anestesiado debe ser monitoreado por la falta de un reflejo de retirada cuando se pellizcan los dedos de los pies para confirmar la profundidad de la anestesia. Se puede administrar una dosis de mantenimiento de ketamina a 1/3 de la dosis original (sin xilacina) si es necesario. - Con la mandíbula y las mejillas retraídas, coloque suavemente la lengua fuera de la boca.
- Para ratones de los grupos C+L+, pipetear 70 μL de PS en el dorso de la lengua (a una de las concentraciones probadas). Mantenga a los ratones en un ambiente oscuro durante un período de 20 minutos como período previo a la irradiación. Asegúrese de que durante este tiempo, la lengua de cada animal permanezca posicionada dentro de la cavidad bucal para evitar que el fotosensibilizador (PS) sea ingerido.
- Después del período de fotosensibilización, saque la lengua de la boca para iluminarla. Coloque el dispositivo LED en el dorso de la lengua e ilumine a 37,5 J/cm2 (7 min con el dispositivo actual) (Figura 3).
- Para los animales de los grupos C+L-, pipetear 70 μL de PS a una de las concentraciones probadas en el dorso de la lengua, y mantener a estos ratones en la oscuridad durante 27 min.
- Para los animales del grupo C-L+ (tratados con luz sin fotosensibilización previa), pipetear 70 μL de suero fisiológico estéril en el dorso de la lengua. Mantenga a los ratones en la oscuridad durante 20 minutos y luego ilumine sus lenguas a 37,5 J/cm2 (7 min con el dispositivo actual).
- Para ratones del grupo C-L- (no tratados con PS ni con luz), pipetear 70 μL de solución salina estéril en el dorso de la lengua y mantenerlos en la oscuridad durante 27 min.
- Recuperar C . albicans de las lenguas de todos los ratones inmediatamente después del tratamiento. Frote el dorso de la lengua durante 1 minuto con un hisopo de algodón estéril.
- Coloque cada hisopo de muestra en un tubo que contenga 1 ml de solución salina estéril y vórtice durante 1 minuto para resuspender las células microbianas.
- Realice inmediatamente diluciones seriadas de 10 veces en PBS y alícuotas de placa de 25 μL sobre placas SDA por duplicado. Incubar las placas aeróbicamente a 37 °C durante 48 h.
- Después de 48 h, use un contador de colonias digital (consulte la Tabla de materiales) para determinar los recuentos de colonias de levaduras. Calcule la carga de C. albicans (UFC/mL) para cada animal.
- Transforme los valores de UFC/ml en log10 y analice adecuadamente de acuerdo con el diseño del experimento y los supuestos de datos.
NOTA: En la presente investigación se utilizó el ANOVA de una vía de Welch y la prueba post-hoc de Games-Howell (α = 0,05)16 .
5. Análisis histopatológicos
- En el octavo día, anestesiar a los ratones con ketamina a 100 mg/kg combinada con xilacina a 10 mg/kg mediante inyección intraperitonial y sacrificarlos con una sobredosis de ketamina (200 mg/kg administrada por vía intraperiotonial). Confirme la muerte comprobando la ausencia de movimientos respiratorios (apnea) y la ausencia de latidos cardíacos (asistolia).
- Pellizca con cuidado la lengua y sácala de la boca del animal. Con un bisturí manual, realice una incisión antes de las papilas circunvaladas para extirpar quirúrgicamente toda la lengua sin causar lesiones en las regiones anterior y central.
- Fijar la lengua en formol tamponado al 10% (pH 7,2-7,4) durante 24 h y lavarla con agua corriente durante 2 h.
- Proceder a la inclusión en el proceso de parafina: deshidratación, clarificación e impregnación10,14.
- Corte secciones seriadas (5 μm de grosor) con un micrótomo y, a continuación, fije las secciones en portaobjetos de vidrio. Se procede a teñir estas secciones utilizando ácido peryódico-Schiff y hematoxilina (PAS-H) para el examen histopatológico y la identificación de hongos mediante la observación bajo un microscopio óptico.
- Pida a un patólogo, preferiblemente ciego a los grupos estudiados, que examine la reacción tisular debida a la infección por C. albicans .
- Describir las características histológicas del tejido (epitelio y tejido conectivo), especialmente las respuestas inflamatorias locales de intensidades variables.
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Representative Results
El modelo murino de OC mostró manchas blancas típicas y pseudomembranas en la lengua de todos los ratones infectados (Figura 4A). C. albicans recuperada de animales C-L- confirmó la colonización tisular por este microorganismo (los valores variaron de 1,62 x 104 a 4,80 x 105 UFC/mL). Como era de esperar, los animales del grupo NCtr no mostraron ninguna alteración tisular ni crecimiento de colonias después del muestreo (Figura 4B).
La aPDT disminuyó la viabilidad de C. albicans cuando se utilizaron curcuminoides a 80 μM para la fotosensibilización (Figura 5). La reducción media logarítmicade 10 alcanzada con 80 μM de aPDT mediada por PS fue de 2,47, en comparación con la del grupo C-L- (p = 0,008).
El número de colonias de C. albicans recuperadas de las lenguas de los ratones no fue significativamente diferente entre los ratones tratados con curcuminoides sin iluminación (grupos C+L-), los ratones tratados con luz pero no fotosensibilizados previamente (grupos C-L+) y los ratones no tratados (grupo C-L-) (p ≥ 0,210).
Las características histológicas de las lenguas de los animales no infectados (NCtr) mostraron tejidos normales/sanos, incluyendo lámina propia, membrana basal y papilas filiformes intactas (Figura 6A). Por el contrario, al examinar las imágenes histopatológicas de las lenguas de los ratones del grupo C-L-, se evidenció que la levadura y los filamentos estaban presentes dentro de la capa queratinizada del epitelio, aunque no hubo infiltración de hongos. En el tejido conectivo subyacente se observó una respuesta inflamatoria leve, mediada principalmente por células mononucleares, y las papilas filiformes brillaron por su ausencia (Figura 6B). El análisis histológico de las lenguas de los ratones en los grupos C+L- y C-L+ mostró características similares. Por el contrario, las secciones de la lengua de los ratones tratados con 80 μM de aPDT mediada por curcuminoides revelaron un número reducido de células fúngicas, limitadas principalmente a la capa queratinizada del epitelio (Figura 6C).
Figura 1: Estructura química del fotosensibilizador. La estructura química de la mezcla de sales solubles en agua utilizada como fotosensibilizador, que comprende un 53,4% de curcumina natural y un 46,6% de otros curcuminoides (demetoxicurcumina y bis-demetoxicurcumina). El peso molecular medio final es de 730,32 g/mol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Cronograma del protocolo para el modelo murino de candidiasis oral y TFDa. Un cronograma que describe el protocolo para el modelo murino de candidiasis oral y terapia fotodinámica antimicrobiana (aPDT). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Iluminación de lenguas de ratones después de la fotosensibilización. Después de la fotosensibilización (incubación del tejido infectado con el fotosensibilizador), las lenguas se iluminaron a 37,5 J/cm2 utilizando una luz LED azul (~455 nm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Lesiones blancas en el modelo murino de candidiasis oral. (A) Imágenes representativas de las lesiones blancas observadas en el modelo murino de candidiasis oral. (B) Control negativo (no infectado). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Candida albicans recuperada de las lenguas de ratones. Los datos representan los valores medios ± la desviación estándar de log10 (UFC/ml) de los grupos de tratamiento. El ANOVA de una vía de Welch indicó que los efectos de los tratamientos fueron estadísticamente significativos diferentes entre los grupos (p < 0,001). Diferentes letras minúsculas (a, b, c) junto a las medias indican diferencias estadísticamente significativas según la prueba de Games-Howell (p≤ 0,030). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Imágenes representativas de cortes histológicos de lenguas de ratón. Las secciones histológicas de las lenguas de ratón se tiñeron con PAS-H y las imágenes se capturaron a 200x. (A) Ratones de control negativo sin candidiasis oral inducida, fotosensibilización e iluminación (grupo NCtr). (B) Ratones con candidiasis oral inducida, ni fotosensibilizados ni expuestos a iluminación LED (grupo C-L-). (C) Animales con candidiasis oral inducida, expuestos a 80 μM de curcuminoides y 37,5 J/cm2 de iluminación LED (grupo C+L+80). Barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Ficha complementaria 1: Grupos experimentales. Listado de los grupos experimentales utilizados en el presente estudio. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
C. albicans se ha asociado con infecciones orales y esofágicas en individuos con estado inmunocomprometido, diabetes mellitus, uso prolongado de antibióticos y mala higiene bucal 1,3. El estudio de las enfermedades infecciosas humanas requiere investigaciones in vitro e in vivo antes de que los ensayos clínicos puedan diseñarse de forma segura y precisa. El presente estudio describe un método para establecer un modelo murino de CO, el cual puede ser utilizado para evaluar la patogenia de las infecciones orales por C. albicans y la eficacia de los abordajes antifúngicos 15,16,17,18,19.
El modelo murino de CO empleado aquí se estableció con éxito, como lo demuestra la recuperación sustancial de la carga fúngica de las lesiones, así como los rasgos característicos de infección observados en los análisis macroscópicos e histopatológicos de las lenguas de los ratones infectados. Muchos estudios han utilizado modelos murinos similares de CO. En estos modelos, los ratones hembra son inmunosuprimidos e inoculados con C. albicans, lo que resulta en lesiones en la lengua 10,13,14,15,20,21. La inmunosupresión con prednisolona, un glucocorticoide, inhibe la actividad de los neutrófilos contra C. albicans22. En este estudio, los ratones hembra fueron inmunosuprimidos con dos inyecciones subcutáneas de prednisolona, un día antes y tres días después de la infección por C. albicans13. Además, la administración de tetraciclina en el agua potable durante el transcurso del experimento causó disbiosis oral al perturbar las bacterias orales y ayudar a C. albicans a prosperar23,24. Además, la sedación causada por la inyección intramuscular de cloruro de clorpromazina impidió que los animales bebieran agua y comieran inmediatamente después de la inoculación. Así, las células fúngicas permanecieron en contacto con el dorso de la lengua durante más tiempo, lo que permitió el desarrollo de tubos germinativos y la transición de levaduras a filamentos (hifas y pseudohifas), que son las morfologías patógenas de C. albicans que pueden invadir el epitelio humano. Teichert et al.25 utilizaron un protocolo de inmunodeficiencia para inducir CO en ratones y recuperaron solo 2 x 102 UFC/mL de C. albicans.
Si bien Totti et al.26 utilizaron ratones sialoadenectomizados y realizaron cuatro inoculaciones separadas con una suspensión de C. albicans , cabe destacar que, en su caso, la infección no se mantuvo en la mayoría de los animales en el transcurso del experimento. Por el contrario, en el presente estudio, la inoculación con células fúngicas se realizó una sola vez, y resultó en la recuperación de 104 UFC/mL de C. albicans de la cavidad oral. En este estudio se empleó el modelo murino de candidiasis descrito por Takakura et al.13, quienes realizaron la inoculación oral con una cepa clínica aislada de un paciente con candidiasis cutánea (106 UFC/mL). De tres a siete días después de la inoculación, se recuperaron 105-10 6 UFC/mL de C. albicans de la cavidad oral de ratones13. Las diferencias entre el método de Takakura et al.13 y este estudio incluyen el uso de diferentes concentraciones de hongos en el inóculo (en este estudio se utilizaron 107 UFC/mL de C. albicans) y diferentes cepas de C. albicans para la inoculación oral (aquí se utilizó la cepa de referencia ATCC 90028). Carmello et al.20 emplearon un protocolo similar, que involucró el uso de animales inmunodeprimidos. Sin embargo, administraron dos inyecciones subcutáneas adicionales de prednisolona a los animales en los días 1, 5, 9 y 13 del experimento. Su estudio reveló una correlación positiva entre las puntuaciones asignadas a las lesiones orales de los animales infectados y el número de UFC/ml durante un período que osciló entre 5 y 16 días después de la infección. Se ha establecido en investigaciones anteriores que es crucial monitorear de cerca a los animales bajo anestesia para prevenir la hipotermia. Las dosis adicionales de mantenimiento de ketamina deben administrarse con discreción, solo cuando sea necesario27.
En cuanto a la eficacia de la aplicación de aPDT, los resultados mostraron que la irradiación de lenguas previamente tratadas con una mezcla de sales curcuminoides de 80 μM provocó una reducción significativa (2,47 log10) en la viabilidad de C. albicans. Los análisis histológicos revelaron que las secciones de lenguas tratadas con 80 μM de aPDT mediada por curcuminoides mostraron un número reducido de células fúngicas, que se limitaron a la capa queratinizada, y una baja respuesta inflamatoria. Cabe destacar que se detectó una respuesta inflamatoria en todos los ratones que estaban infectados con C. albicans. Esta observación implica que la inflamación observada en todos los grupos de aPDT podría estar relacionada con la infección por Candida en lugar de ser atribuida a la aPDT, un hallazgo consistente en línea con nuestras investigaciones previas 10,13,14,15.
Investigaciones previas utilizaron CUR, azul de metileno y fotoditazina (PDZ) como PS y obtuvieron resultados promisorios 10,20,24,25,27. En un estudio similar10, una exposición combinada a la luz CUR y LED causó una reducción significativa en la viabilidad de C. albicans; sin embargo, el uso de 80 μM de CUR y luz redujo la viabilidad fúngica en 4,0 log10. Dovigo et al.10 utilizaron solo CUR como PS, mientras que nosotros utilizamos una sal que contenía los tres principales curcuminoides de C. longa. Cuando se utilizaron CUR (260 μM) y luz LED durante cinco días consecutivos en el tratamiento de la candidiasis oral en ratones, los autores observaron una reducción de 1,11 log10 en la viabilidad fúngica21. Cuando se utilizó azul de metileno como PS a 450 μg/mL y 500 μg/mL, la aPDT erradicó totalmente C. albicans de la cavidad oral de los ratones25. Además, cuando la TFDa fue mediada por PDZ (100 mg/L), se observó una reducción de 3,0 log10 y una remisión completa de las lesiones orales20. Además, la aPDT aumentó la expresión de TNF-α en comparación con la del grupo no tratado20. En un estudio en el que se utilizó una cepa resistente a fluconazol, la aPDT mediada por PDZ (200 mg/L) promovió una reducción equivalente a 1,3 log1027. Además, la combinación de aPDT con nistatina resultó en una reducción sustancial de la viabilidad fúngica, ascendiendo a una disminución de 2,6 log10, junto con mejoras notables en las lesiones orales y una reducción en la respuesta inflamatoria27. En conjunto, estos estudios proporcionan pruebas convincentes de la eficacia de la aPDT en la reducción de la carga fúngica dentro del modelo murino de candidiasis oral, subrayando su potencial como opción de tratamiento clínico debido a su eficacia antimicrobiana sin causar daño a los tejidos del huésped.
En conclusión, el modelo murino de CO utilizado en este estudio es apropiado para imitar la infección y evaluar la eficacia de la aPDT. Como limitación, el modelo de CO utilizado aquí empleó solo una cepa de referencia de C. albicans (no se evaluaron otras cepas, aislamientos clínicos y especies de Candida no albicans). Además, la inmunosupresión inducida por corticosteroides utilizada en ratones para desarrollar infección oral puede no imitar otros estados de inmunodeficiencia, como la debida a la infección por VIH. También puede haber diferencias en las condiciones del huésped para desarrollar CO, como la microbiota oral de ratones y humanos. Este protocolo debe ampliarse aún más para evaluar las biopelículas mixtas formadas por más de una especie o por diferentes cepas de la misma especie. Además, mantener a los ratones adecuadamente sedados y prevenir la hipotermia mientras se evita la mortalidad relacionada con la anestesia son los pasos más difíciles del protocolo.
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Acknowledgments
Los autores agradecen el apoyo financiero de la FAPESP (Fundación de Apoyo a la Investigación Científica del Estado de São Paulo, número de proceso FAPESP #2013/07276-1 (CePID CePOF) y 2008/00601-6. También agradecemos a la Dra. Ana Paula Silva por brindar la información sobre la sal soluble en agua a base de CUR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. albicans | ATCC (Rockville, Md, USA) | 90028 | Used to prepare the Candida inoculum |
| Centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5804/5804R,B. Braun, Melsungen, Hesse, Germany | 022628146 (NA) | Used to prepare the Candida inoculum |
| Chlorpromazine chloride 2 mg/mL | Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil | - | Used to sedate animals during candida inoculation |
| Curcumin-based water-soluble salt | PDTPharma, Cravinhos, Brazil | - | Consisting of 53.4% of natural curcumin, and 46.6% of other curcuminoids (demethoxycurcumin and bis-demethoxycurcumin). Prepared in water and N-MethylD-Glucamine (final average molecular weight of 730.32 g.mol−1) |
| Digital colony counter | CP 600 Plus, Phoenix Ind Com Equipamentos Científicos Ltda, Araraquara, SP, Brazil | - | Used to count colonies on agar plates |
| Extruded mouse chow | Benelab food, Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda., Lindóia, São Paulo State, Brazil. | - | Used for the feeding of the mice |
| Ketamine Hydrochloride 10% | Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil | - | Used to anesthetize animals before treatments and for euthanasia |
| Light-emitting diode handpiece (prototype) | Instituto de Física de São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, SP, Brazil | - | Fabricated with LXHL-PR09, Luxeon III Emitter, Lumileds Lighting, San Jose, California, USA |
| Methylprednisolone acetate 40 mg | DEPO-MEDROL, Pfizer, New York | - | Used as an immunosuppressant |
| Microtome | Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA | SM2500 | Used to cut the serial sections of the tongues |
| Propylene boxes (cages housing) H13 x L20 x D30 cm | Bonther Equipaments, Ribeirão Preto, SP, Brazil | - | Used to keep the animals throughout the experimental period |
| Sabouraud Dextrose Agar with Chloramphenicol | HiMedia, Mumbai, India | MM1067-500G | Culture medium for yeast growth (agar) |
| Spectrophotometer | Spectrophotometer Kasvi K37-VIS , São José dos Pinhais, PR, Brazil | K37-VIS | Used to standardize the inoculum concentration |
| Tetracycline hydrochloride | Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil | - | Antibiotic given to induce oral dysbiosis |
| Wood shavings | J.R. Wood Shavings, Comerce of Sawdust Ltda., Conchal, São Paulo State, Brazil | - | Used for floor covering inside the housing boxes |
| Xylazine 2% | Calmiun, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil | - | Used in combination with ketamine for anesthesia |
| Yeast Nitrogen Broth | Difco, InterLab, Detroit, MI, USA | DF0919-07-3 | Culture medium for yeast growth (broth) |
| Yeast Peptone Dextrose Broth | NutriSelect Basic, Sigma Aldrich | Y1375 | Culture medium for maintaining the strains at -80°C and grow |
References
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